本文選題：IR-780　切入點：真皮細胞　出處：《第三軍醫(yī)大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景皮膚創(chuàng)傷修復是一個復雜的生物學過程,影響成體皮膚創(chuàng)傷愈合的因素包括細胞外基質、細胞因子、炎癥細胞、修復細胞等。在修復過程中原位真皮細胞是主要的修復細胞,能夠轉化為肌成纖維細胞,造成大量細胞外基質沉積,并收縮創(chuàng)面,最終導致瘢痕形成。既往研究顯示真皮細胞具有顯著的異質性。譜系示蹤發(fā)現(xiàn)真皮細胞中含有高纖維化潛能的細胞亞群,由于真皮細胞亞群間缺乏特異性的標志物,因此,探索鑒別人真皮細胞亞群的新技術對于研究真皮細胞各亞群標志物以及在創(chuàng)傷修復和纖維化過程中的作用具有非常重要的意義。本課題組研究發(fā)現(xiàn)七甲川花菁染料IR-780能夠鑒別高纖維化潛能的真皮細胞亞群并依賴糖酵解表型,為皮膚纖維化的研究提供了潛在的技術手段。研究方法1.高攝取IR-780真皮細胞亞群(IR-780H)的分選與生物學特性的研究CCK-8用于檢測體外IR-780對真皮細胞的毒性作用,選取安全濃度進行標記,鑒別出IR-780H真皮細胞亞群。采用流式分選的方法將其分離,通過近紅外熒光顯微鏡觀察熒光強度驗證流式分選的準確性。通過形態(tài)學觀察、CCK-8增殖能力檢測法和集落形成能力等指標檢測IR-780H真皮細胞亞群的形態(tài)、增殖能力和自我更新能力。進一步Real-time PCR檢測IR-780H真皮細胞亞群的膜轉運蛋白、糖酵解代謝相關酶基因的表達,并使用能量代謝檢測儀檢測其糖酵解活性。2.高攝取IR-780真皮細胞亞群纖維化相關特性的研究使用Real-time PCR、免疫熒光和Western blot法檢測IR-780H真皮細胞亞群的細胞外基質及纖維化相關因子表達水平;通過Real-time PCR檢測標記條件下的IR-780對細胞外基質及纖維化相關因子表達的影響;免疫熒光法檢測IR-780H真皮細胞亞群α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達,以及在轉化生長因子β1(TGF-β1)刺激下轉化為肌成纖維細胞的能力;觀察體內創(chuàng)傷模型移植IR-780H真皮細胞亞群對創(chuàng)傷愈合的影響,進一步明確IR-780H真皮細胞亞群的纖維化潛能。研究結果1.高攝取IR-780真皮細胞亞群的分選與生物學特性的研究通過對IR-780作用于真皮細胞的毒性實驗,篩選出安全標記濃度,成功建立流式分選IR-780H真皮細胞亞群的方法,同時近紅外熒光顯微鏡下檢測熒光強度證實了流式分選的準確性。形態(tài)學觀察、CCK-8檢測法和集落形成能力檢測發(fā)現(xiàn)IR-780H真皮細胞亞群相較低攝取IR-780的真皮細胞亞群(IR-780C)具有更扁平的形態(tài)、較差的增殖能力和較低的自我更新能力。進一步發(fā)現(xiàn)IR-780H真皮細胞亞群細胞膜轉運蛋白OATP1B3、糖酵解代謝相關酶PFK1、PFK2、LDH基因表達明顯高于IR-780C;能量代謝檢測發(fā)現(xiàn)IR-780H真皮細胞亞群糖酵解水平較高,證明IR-780能用于分離存在能量代謝差異的真皮細胞亞群。2.高攝取IR-780真皮細胞亞群纖維化相關特性的研究檢測細胞外基質及纖維化相關因子水平,發(fā)現(xiàn)IR-780H真皮細胞亞群表達I型膠原、纖維連接蛋白和多功能蛋白聚糖細胞外基質及纖維化相關因子TGF-β1、CTGF的水平較IR-780C明顯升高,并證實IR-780標記對真皮細胞中這些因子的表達無影響;通過檢測肌成纖維細胞特異性的標志物(α-SMA)發(fā)現(xiàn)IR-780H真皮細胞亞群在TGF-β1刺激下向肌成纖維細胞轉化的能力較IR-780C顯著增強;動物實驗結果顯示,將IR-780H真皮細胞亞群移植到全層皮膚損傷大鼠模型后能明顯促進創(chuàng)面收縮、增強創(chuàng)面局部的膠原沉積。研究結論1.首次揭示七甲川花菁染料IR-780可用于鑒別真皮細胞中具有高纖維化潛能的細胞亞群并依賴糖酵解代謝表型,探索建立了IR-780分選高纖維化潛能真皮細胞亞群的技術方法。2.通過檢測細胞外基質、纖維化相關因子以及在TGF-β1刺激下向肌成纖維細胞轉化的能力,初步證實IR-780H真皮細胞亞群的高纖維化潛能;通過創(chuàng)傷模型中瘢痕厚度與膠原沉積情況,體內證明IR-780H真皮細胞亞群的高纖維化潛能。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R641

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