本文選題：IR-780　切入點(diǎn)：真皮細(xì)胞　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景皮膚創(chuàng)傷修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程,影響成體皮膚創(chuàng)傷愈合的因素包括細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子、炎癥細(xì)胞、修復(fù)細(xì)胞等。在修復(fù)過(guò)程中原位真皮細(xì)胞是主要的修復(fù)細(xì)胞,能夠轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,造成大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積,并收縮創(chuàng)面,最終導(dǎo)致瘢痕形成。既往研究顯示真皮細(xì)胞具有顯著的異質(zhì)性。譜系示蹤發(fā)現(xiàn)真皮細(xì)胞中含有高纖維化潛能的細(xì)胞亞群,由于真皮細(xì)胞亞群間缺乏特異性的標(biāo)志物,因此,探索鑒別人真皮細(xì)胞亞群的新技術(shù)對(duì)于研究真皮細(xì)胞各亞群標(biāo)志物以及在創(chuàng)傷修復(fù)和纖維化過(guò)程中的作用具有非常重要的意義。本課題組研究發(fā)現(xiàn)七甲川花菁染料IR-780能夠鑒別高纖維化潛能的真皮細(xì)胞亞群并依賴(lài)糖酵解表型,為皮膚纖維化的研究提供了潛在的技術(shù)手段。研究方法1.高攝取IR-780真皮細(xì)胞亞群(IR-780H)的分選與生物學(xué)特性的研究CCK-8用于檢測(cè)體外IR-780對(duì)真皮細(xì)胞的毒性作用,選取安全濃度進(jìn)行標(biāo)記,鑒別出IR-780H真皮細(xì)胞亞群。采用流式分選的方法將其分離,通過(guò)近紅外熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度驗(yàn)證流式分選的準(zhǔn)確性。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、CCK-8增殖能力檢測(cè)法和集落形成能力等指標(biāo)檢測(cè)IR-780H真皮細(xì)胞亞群的形態(tài)、增殖能力和自我更新能力。進(jìn)一步Real-time PCR檢測(cè)IR-780H真皮細(xì)胞亞群的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、糖酵解代謝相關(guān)酶基因的表達(dá),并使用能量代謝檢測(cè)儀檢測(cè)其糖酵解活性。2.高攝取IR-780真皮細(xì)胞亞群纖維化相關(guān)特性的研究使用Real-time PCR、免疫熒光和Western blot法檢測(cè)IR-780H真皮細(xì)胞亞群的細(xì)胞外基質(zhì)及纖維化相關(guān)因子表達(dá)水平;通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)標(biāo)記條件下的IR-780對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)及纖維化相關(guān)因子表達(dá)的影響;免疫熒光法檢測(cè)IR-780H真皮細(xì)胞亞群α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá),以及在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)刺激下轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的能力;觀察體內(nèi)創(chuàng)傷模型移植IR-780H真皮細(xì)胞亞群對(duì)創(chuàng)傷愈合的影響,進(jìn)一步明確IR-780H真皮細(xì)胞亞群的纖維化潛能。研究結(jié)果1.高攝取IR-780真皮細(xì)胞亞群的分選與生物學(xué)特性的研究通過(guò)對(duì)IR-780作用于真皮細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn),篩選出安全標(biāo)記濃度,成功建立流式分選IR-780H真皮細(xì)胞亞群的方法,同時(shí)近紅外熒光顯微鏡下檢測(cè)熒光強(qiáng)度證實(shí)了流式分選的準(zhǔn)確性。形態(tài)學(xué)觀察、CCK-8檢測(cè)法和集落形成能力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IR-780H真皮細(xì)胞亞群相較低攝取IR-780的真皮細(xì)胞亞群(IR-780C)具有更扁平的形態(tài)、較差的增殖能力和較低的自我更新能力。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)IR-780H真皮細(xì)胞亞群細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OATP1B3、糖酵解代謝相關(guān)酶PFK1、PFK2、LDH基因表達(dá)明顯高于IR-780C;能量代謝檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IR-780H真皮細(xì)胞亞群糖酵解水平較高,證明IR-780能用于分離存在能量代謝差異的真皮細(xì)胞亞群。2.高攝取IR-780真皮細(xì)胞亞群纖維化相關(guān)特性的研究檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)及纖維化相關(guān)因子水平,發(fā)現(xiàn)IR-780H真皮細(xì)胞亞群表達(dá)I型膠原、纖維連接蛋白和多功能蛋白聚糖細(xì)胞外基質(zhì)及纖維化相關(guān)因子TGF-β1、CTGF的水平較IR-780C明顯升高,并證實(shí)IR-780標(biāo)記對(duì)真皮細(xì)胞中這些因子的表達(dá)無(wú)影響;通過(guò)檢測(cè)肌成纖維細(xì)胞特異性的標(biāo)志物(α-SMA)發(fā)現(xiàn)IR-780H真皮細(xì)胞亞群在TGF-β1刺激下向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力較IR-780C顯著增強(qiáng);動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,將IR-780H真皮細(xì)胞亞群移植到全層皮膚損傷大鼠模型后能明顯促進(jìn)創(chuàng)面收縮、增強(qiáng)創(chuàng)面局部的膠原沉積。研究結(jié)論1.首次揭示七甲川花菁染料IR-780可用于鑒別真皮細(xì)胞中具有高纖維化潛能的細(xì)胞亞群并依賴(lài)糖酵解代謝表型,探索建立了IR-780分選高纖維化潛能真皮細(xì)胞亞群的技術(shù)方法。2.通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)、纖維化相關(guān)因子以及在TGF-β1刺激下向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力,初步證實(shí)IR-780H真皮細(xì)胞亞群的高纖維化潛能;通過(guò)創(chuàng)傷模型中瘢痕厚度與膠原沉積情況,體內(nèi)證明IR-780H真皮細(xì)胞亞群的高纖維化潛能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R641

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本文編號(hào)：1619871