本文關(guān)鍵詞：SezAT系統(tǒng)及PlcR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在2型豬鏈球菌中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：2型豬鏈球菌(Streptococcus suis serotype2，SS2)作為一種重要的人畜共患病原菌，不僅可引起世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失，還威脅著公共衛(wèi)生安全。它在人間呈散發(fā)感染，所引起的病理表現(xiàn)通常只限于腦、心、肺及關(guān)節(jié)，且預(yù)后良好。然而，我國(guó)1998年江蘇、2005年四川暴發(fā)的兩起大規(guī)模SS2感染人的疫情卻與既往報(bào)道的感染特點(diǎn)有顯著不同：第一，首次出現(xiàn)大規(guī)模人群感染病例；第二，有很高比例的感染者呈現(xiàn)出典型的鏈球菌中毒性休克綜合征(Streptococcal toxic shock syndrome，STSS)的臨床癥狀，即使對(duì)這些患者使用大劑量抗生素干預(yù)，也無(wú)法扭轉(zhuǎn)病程，許多患者都因?yàn)楦腥維S2后引起機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子的瀑布式爆發(fā)而死亡。以上情況強(qiáng)烈提示，我國(guó)疫區(qū)出現(xiàn)了高致病性SS2變異株。 為了對(duì)我國(guó)SS2流行菌株的高致病性進(jìn)行深入研究，課題組前期利用基因芯片結(jié)合比較基因組學(xué)技術(shù)，將不同毒力、不同來(lái)源的18株SS2菌株基因組進(jìn)行系統(tǒng)分析，從全基因組水平研究SS2在毒力和環(huán)境適應(yīng)力方面的進(jìn)化，發(fā)現(xiàn)我國(guó)SS2流行菌株所特有的89K毒力島(89K PAI)，在其他一些SS2菌株基因組中部分存在且呈現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，還鑒定出了一些毒力因子為強(qiáng)毒株所特有。因此，在我國(guó)疫情株中特有的89K毒力島和未被研究的毒力相關(guān)因子候選基因?qū)?型豬鏈球菌致病性的貢獻(xiàn)引起了我們的濃厚興趣。本文從以下2個(gè)方面對(duì)2型豬鏈球菌進(jìn)行研究： 1.毒素-抗毒素(TA)系統(tǒng)SezAT在穩(wěn)定89K致病島中的作用。課題組前期的研究工作發(fā)現(xiàn)了我國(guó)高致病性SS2基因組特有的89K毒力島，該毒力島可以從宿主菌染色體上自發(fā)地切離并形成環(huán)形質(zhì)粒樣分子。為深入研究89K毒力島的功能，課題組試圖通過(guò)消除質(zhì)粒的方法消除89K，始終未果。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)89K上存在一個(gè)毒素-抗毒素(TA)系統(tǒng)SezAT，而TA系統(tǒng)是近年證實(shí)的一類能穩(wěn)定質(zhì)粒和基因組島等遺傳元件的功能系統(tǒng)。為揭示SezAT對(duì)89K毒力島的穩(wěn)定作用，本研究首先通過(guò)同源重組破壞SezAT系統(tǒng)，然后通過(guò)Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)介導(dǎo)89K毒力島的消除，篩選89K缺失株，并采用相同的重組工具嘗試對(duì)沒(méi)有破壞SezAT系統(tǒng)的89K毒力島進(jìn)行消除實(shí)驗(yàn)，以此作為對(duì)照，從而證實(shí)SezAT毒素-抗毒素系統(tǒng)的確為89K毒力島上極其重要的穩(wěn)定元件。利用基本生物學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)89K消除對(duì)SS2表型的影響。 2.轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PlcR在致病性中的作用。課題組前期的研究工作鑒定出了一些毒力因子為強(qiáng)毒株所特有，在所鑒定的毒力因子中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PlcR由于在調(diào)節(jié)芽胞桿菌屬細(xì)菌的毒力方面起十分重要的作用，且目前它在鏈球菌屬中的功能研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，這使得我們對(duì)它產(chǎn)生了興趣。為了探究PlcR在SS2致病過(guò)程中的作用，本研究利用生物信息學(xué)分析手段對(duì)其功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，此后再通過(guò)同源重組的方法敲除plcR基因，研究PlcR在SS2致病過(guò)程中的作用。 本文的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果主要包括以下幾個(gè)方面： 1. SezAT系統(tǒng)基因敲除株的構(gòu)建：依據(jù)同源重組原理設(shè)計(jì)sezT基因敲除載體，該載體上的篩選用標(biāo)記壯觀霉素抗性基因盒Spcr兩側(cè)添加了Cre重組酶識(shí)別位點(diǎn)loxP，將該敲除載體電轉(zhuǎn)05ZYH33電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)篩選具壯觀霉素抗性表型的菌株，結(jié)合多重交叉PCR以及測(cè)序鑒定的方法，獲得sezT基因缺失突變株。再以此菌株制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)，轉(zhuǎn)入表達(dá)Cre重組酶的質(zhì)粒pCrePA2，30℃培養(yǎng)條件刪除抗性基因Spcr后，37℃培養(yǎng)條件消除質(zhì)粒pCrePA2。通過(guò)多重PCR和測(cè)序的方法篩選鑒定得到不含抗性篩選標(biāo)記的sezTloxP+/Spc-菌株，證實(shí)Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在SS2中可以工作。 2.破壞SezAT系統(tǒng)的89K毒力島的消除實(shí)驗(yàn)：依據(jù)同源重組原理，設(shè)計(jì)attL右側(cè)loxP位點(diǎn)敲入質(zhì)粒和attR左側(cè)loxP位點(diǎn)敲入質(zhì)粒。首先將attL右側(cè)loxP位點(diǎn)敲入質(zhì)粒電轉(zhuǎn)sezTloxP+/Spc-電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)篩選具氯霉素抗性表型的菌株，結(jié)合多重交叉PCR以及測(cè)序鑒定的方法，獲得attL右側(cè)引入loxP位點(diǎn)的sezTloxP+/Spc-。再以此菌株制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)入表達(dá)Cre重組酶的質(zhì)粒pCrePA2，30℃培養(yǎng)條件消除89K毒力島左半部后，37℃培養(yǎng)條件消除質(zhì)粒pCrePA2。通過(guò)平行接種培養(yǎng)、多重PCR和測(cè)序的方法篩選鑒定得到89K毒力島左半部缺失突變株。之后再將attR左側(cè)loxP位點(diǎn)敲入質(zhì)粒電轉(zhuǎn)89K毒力島左半部缺失突變株電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)篩選具壯觀霉素抗性表型的菌株，結(jié)合多重交叉PCR以及測(cè)序鑒定的方法，獲得attR左側(cè)引入loxP位點(diǎn)的89K毒力島左半部缺失突變株，再以此菌株制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)入表達(dá)Cre重組酶的質(zhì)粒pCrePA2，30℃培養(yǎng)條件消除89K毒力島右半部后，37℃培養(yǎng)條件消除質(zhì)粒pCrePA2。通過(guò)平行接種培養(yǎng)、多重PCR和測(cè)序的方法篩選鑒定得到89K毒力島缺失突變株89K。 3.未破壞SezAT系統(tǒng)的89K毒力島的消除嘗試：將attL右側(cè)loxP位點(diǎn)敲入質(zhì)粒電轉(zhuǎn)05ZYH33電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)篩選具氯霉素抗性表型的菌株，結(jié)合多重交叉PCR以及測(cè)序鑒定的方法，獲得attL右側(cè)引入loxP位點(diǎn)的05ZYH33菌株。再以此菌株制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)入attR左側(cè)loxP位點(diǎn)敲入質(zhì)粒，通過(guò)篩選具壯觀霉素抗性表型的菌株，結(jié)合多重交叉PCR以及測(cè)序鑒定的方法，獲得attL右側(cè)引入loxP位點(diǎn)且attR左側(cè)引入loxP位點(diǎn)的05ZYH33菌株，再以此菌株制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)入表達(dá)Cre重組酶的質(zhì)粒pCrePA2，30℃培養(yǎng)條件消除89K毒力島右半部后，37℃培養(yǎng)條件消除質(zhì)粒pCrePA2。通過(guò)平行接種培養(yǎng)、PCR的方法篩選89K毒力島缺失突變株89K，沒(méi)有獲得89K缺失突變株。此項(xiàng)對(duì)照實(shí)驗(yàn)凸顯了SezAT系統(tǒng)對(duì)89K毒力島具有極其重要的穩(wěn)定作用。 4.89K菌株的基本生物學(xué)性狀分析：相同培養(yǎng)條件下比較野生株05ZYH33與突變株89K在生長(zhǎng)曲線、溶血活性以及莢膜形態(tài)上的差異。結(jié)果顯示，缺失89K毒力島對(duì)SS2的這3個(gè)基本生物學(xué)性狀沒(méi)有顯著影響。 5. PlcR的生物信息學(xué)分析：運(yùn)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST比對(duì)工具對(duì)05SSU0241和05SSU0242基因的編碼產(chǎn)物進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)二者與蠟樣芽胞桿菌的PlcR蛋白的相似性分別為46%與28%，再利用Pfam軟件和InterPro軟件對(duì)這2個(gè)基因的編碼產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，分析結(jié)果顯示05SSU0241基因編碼產(chǎn)物含有一個(gè)λ抑制子樣的HTH結(jié)構(gòu)域((Lambda repressor-like helix-turn-helix domain)，這一結(jié)構(gòu)域?yàn)樘禺惖腄NA結(jié)合區(qū)域，許多具有此結(jié)構(gòu)域的蛋白都發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的作用。05SSU0242基因編碼產(chǎn)物含有一個(gè)肽重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(Tetratricopeptide repeat，TPR)，這種結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用，并在一些重要的蛋白復(fù)合物的形成中扮演重要角色。這些生物信息學(xué)分析結(jié)果都提示，05SSU0241與05SSU0242可能就是鏈球菌屬中的plcR基因，對(duì)相關(guān)基因行使轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，但尚需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。 6. plcR基因缺失突變株的構(gòu)建：依據(jù)同源重組原理設(shè)計(jì)plcR基因敲除載體，以05ZYH33基因組DNA為模板，，分別擴(kuò)增plcR基因上下游片段作為plcR基因敲除載體的同源左右臂，再以pSET4S質(zhì)粒DNA為模板，擴(kuò)增得到抗性基因盒Spcr，將所得片段純化后依次連接到pUC18載體中，成功構(gòu)建plcR基因敲除載體。將該載體電轉(zhuǎn)05ZYH33電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，篩選壯觀霉素抗性表型的菌株，結(jié)合多重交叉PCR和測(cè)序的方法鑒定獲得plcR基因缺失突變株plcR。 7. plcR基因與SS2毒力關(guān)系的初探：采用相同菌量(107CFU/ml)的野生株05ZYH33和突變株plcR攻擊BALB/c雌性4周齡小鼠，將兩組小鼠分別命名為野生組與敲除組，結(jié)果顯示，這2組小鼠均出現(xiàn)典型的SS2感染癥狀，但是敲除組在感染12h后不再有小鼠死亡，且存活小鼠預(yù)后良好，死亡率為30%，而野生組小鼠感染癥狀較敲除組嚴(yán)重，死亡率為60%，小鼠攻毒實(shí)驗(yàn)顯示，plcR基因缺失突變株的毒力較野生株顯著降低，這提示我們plcR基因與SS2的致病性相關(guān)。 綜上所述，本文通過(guò)比較SezAT毒素-抗毒素系統(tǒng)破壞前后，利用Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)消除89K毒力島的效率，證實(shí)SezAT系統(tǒng)作為極其重要的穩(wěn)定元件在89K毒力島穩(wěn)定存在于基因組中發(fā)揮關(guān)鍵作用。再通過(guò)89K毒力島缺失前后的基本生物學(xué)性狀的差異比較，發(fā)現(xiàn)89K毒力島對(duì)實(shí)驗(yàn)中考察的3個(gè)基本生物學(xué)性狀沒(méi)有顯著影響，獲得了一株89K毒力島缺失突變株，為后續(xù)研究89K PAI對(duì)SS2致病性的貢獻(xiàn)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。另一部分對(duì)于PlcR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的生物信息學(xué)分析結(jié)果提示SS2中的plcR基因可能存在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，通過(guò)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建plcR基因缺失突變株，比較野生株05ZYH33與突變株plcR對(duì)小鼠的致死率，結(jié)果顯示，plcR基因確實(shí)與SS2的致病性存在相關(guān)性。
【關(guān)鍵詞】：2型豬鏈球菌 89K毒力島 TA系統(tǒng) Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng) plcR基因 基因敲除
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表6-8
• Abstract8-12
• 摘要12-16
• 引言16-18
• 第一部分 毒素-抗毒素系統(tǒng) SezAT 在高致病性 2 型豬鏈球菌 89K 毒力島中的穩(wěn)定作用研究18-101
• 前言18-22
• 第一章 SezAT 系統(tǒng)基因敲除株的構(gòu)建22-48
• 前言22
• 1.1 SezAT 系統(tǒng)的基因敲除22-34
• 1.1.1 主要儀器、材料、試劑22-24
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法24-30
• 1.1.3 結(jié)果30-33
• 1.1.4 討論33-34
• 1.2 Cre/loxP 位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)介導(dǎo)的抗性基因刪除34-48
• 1.2.1 主要儀器、材料、試劑34-35
• 1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法35-40
• 1.2.3 結(jié)果40-45
• 1.2.4 討論45-48
• 第二章 89K 毒力島缺失突變株的構(gòu)建48-84
• 前言48-49
• 2.1 主要儀器、材料、試劑49
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法49-67
• 2.3 結(jié)果67-82
• 2.4 討論82-84
• 第三章 Cre/loxP 系統(tǒng)消除野生型 89K 毒力島的嘗試84-96
• 前言84
• 3.1 主要儀器、材料、試劑84
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法84-86
• 3.3 結(jié)果86-92
• 3.4 討論92-96
• 第四章 89K 毒力島缺失對(duì)高致病性 2 型豬鏈球菌基本生物學(xué)性狀的影響96-101
• 前言96
• 4.1 主要儀器、材料、試劑96
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法96-97
• 4.3 結(jié)果97-99
• 4.4 討論99-101
• 第二部分 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 PlcR 調(diào)節(jié)高致病性 2 型豬鏈球菌毒力的研究101-125
• 前言101-104
• 第五章 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 PlcR 的分析鑒定104-111
• 前言104
• 5.1 plcR 基因的生物信息學(xué)分析104-106
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)方法104-105
• 5.1.2 結(jié)果105-106
• 5.1.3 討論106
• 5.2 plcR 基因的共轉(zhuǎn)錄分析106-111
• 5.2.1 主要儀器、材料、試劑106
• 5.2.2 實(shí)驗(yàn)方法106-109
• 5.2.3 結(jié)果109-110
• 5.2.4 討論110-111
• 第六章 plcR 基因敲除株的構(gòu)建及 plcR 缺失對(duì)細(xì)菌毒力的影響111-125
• 前言111
• 6.1 plcR 基因敲除株的構(gòu)建111-120
• 6.1.1 主要儀器、材料、試劑111
• 6.1.2 實(shí)驗(yàn)方法111-116
• 6.1.3 結(jié)果116-118
• 6.1.4 討論118-120
• 6.2 plcR 基因敲除對(duì)細(xì)菌毒力的影響120-125
• 6.2.1 主要儀器、材料、試劑120
• 6.2.2 實(shí)驗(yàn)方法120-121
• 6.2.3 結(jié)果121-122
• 6.2.4 討論122-125
• 全文總結(jié)125-126
• 參考文獻(xiàn)126-133
• 文獻(xiàn)綜述133-151
• 參考文獻(xiàn)147-151
• 攻讀碩士期間發(fā)表的文章151-152
• 致謝152

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 胡力文;鄒凌云;倪青山;姚新月;朱軍民;李明;胡福泉;;2型豬鏈球菌89K致病島進(jìn)化途徑分析[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2012年06期

2 王敏;李明;鐘秋;趙巖;饒賢才;黎庶;譚銀玲;胡福泉;;高致病性2型豬鏈球菌毒素-抗毒素系統(tǒng)SezAT的鑒定與活性研究[J];微生物學(xué)通報(bào);2012年02期

  本文關(guān)鍵詞：SezAT系統(tǒng)及PlcR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在2型豬鏈球菌中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：430214