本文關(guān)鍵詞：畸形表皮自調(diào)節(jié)因子1相關(guān)功能蛋白的篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的獲得畸形表皮自調(diào)節(jié)因子1(DEAF1)穩(wěn)定高表達(dá)的HEK293T細(xì)胞株,通過免疫共沉淀(Co-IP)和質(zhì)譜分析技術(shù)篩選能與DEAF1相互作用的蛋白質(zhì)因子。方法用Turbo Fect轉(zhuǎn)染試劑將p EGFP-m DEAF1和p EGFP-N1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞和2F-2B細(xì)胞、熒光顯微鏡觀察DEAF1在2種細(xì)胞中的定位。將質(zhì)粒p3×FLAG-m DEAF1分別轉(zhuǎn)染HEK293T和2F-2B細(xì)胞株,同時設(shè)置相應(yīng)未轉(zhuǎn)染的空白對照組;通過反轉(zhuǎn)錄PCR法和實(shí)時定量PCR(qRT-PCR)檢測DEAF1在2種細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平,通過Western blot法檢測DEAF1在2種細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平。p3×FLAG-m DEAF1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,G418篩選陽性克隆,Western blot法、免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)鑒定DEAF1穩(wěn)定表達(dá)的HEK293T-DEAF1細(xì)胞株。抽提HEK293T-DEAF1細(xì)胞和正常HEK293T細(xì)胞的核蛋白,用EZviewTMRed ANTI-FLAG M2親和珠子進(jìn)行Co-IP,SDS-PAGE分離,挑選明顯富集和對照泳道沒有的條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析,明確DEAF1的相關(guān)功能蛋白。結(jié)果熒光顯微鏡下可見DEAF1定位于細(xì)胞核;反轉(zhuǎn)錄PCR、qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組DEAF1的mRNA表達(dá)水平明顯高于未轉(zhuǎn)染組;Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組有融合蛋白m DEAF1-FLAG表達(dá),成功獲得穩(wěn)定高表達(dá)DEAF1的HEK293T-DEAF1細(xì)胞。經(jīng)Co-IP篩選和質(zhì)譜分析,得到一些DEAF1的相關(guān)功能蛋白,如前mRNA處理所需的因子及酶,參與起始后RNA聚合酶,參與肽鍵斷裂、蛋白空間結(jié)構(gòu)形成的分子和其他轉(zhuǎn)錄因子等。結(jié)論成功獲得穩(wěn)定高表達(dá)DEAF1的HEK293T-DEAF1細(xì)胞,經(jīng)Co-IP篩選和質(zhì)譜分析獲得了一些DEAF1相關(guān)的功能蛋白。
【作者單位】： 三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院;湖北省荊門市第二人民醫(yī)院心血管內(nèi)科;
【關(guān)鍵詞】： DEAF 穩(wěn)定表達(dá) 免疫共沉淀 質(zhì)譜分析 篩選
【基金】：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81172788)
【分類號】：R392
【正文快照】： 外周淋巴器官中,誘導(dǎo)外周免疫耐受是通過多種外周組織特異抗原的異位表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的[1]。在小鼠胰淋巴結(jié)基質(zhì)細(xì)胞中有一系列外周組織抗原(peripheral tissue antigens,PTA)基因的表達(dá),且PTA基因的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子畸形表皮自調(diào)節(jié)因子1(deformed epidermal autoregulatory factor-1

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