本文關(guān)鍵詞：MUC2基因表達與益生菌抑制大腸桿菌K1株黏附侵襲腸上皮細(xì)胞的關(guān)系研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一、研究背景 黏蛋白(Mucin)是由體內(nèi)多種上皮細(xì)胞分泌的大分子量糖蛋白。根據(jù)其結(jié)構(gòu)的不同可分為分泌型和膜結(jié)合型。在正常情況下,黏蛋白除了對上皮細(xì)胞組織起保護作用外,還參與上皮細(xì)胞的分類和更新,細(xì)胞黏附和細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)等。在病理狀態(tài)下,黏蛋白在惡性腫瘤及癌病變中的表達發(fā)生異常。MUC2屬于分泌型黏蛋白,在結(jié)腸、小腸及呼吸道上皮細(xì)胞中均有表達。該蛋白質(zhì)在腸道的表面形成一層粘液層發(fā)揮潤滑和拮抗致病菌的腸道黏附和侵襲的作用。在正常情況下,MUC2100%表達于腸道粘膜上皮,而在大腸腫瘤中表達降低。目前已在多種上皮來源的腫瘤及腸道疾病中發(fā)現(xiàn)黏蛋白的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變,出現(xiàn)黏蛋白的異常表達,其異常表達與臨床預(yù)后相關(guān)。Ho等研究顯示MUC2的異常表達與其啟動子高甲基化相關(guān),并且已有研究顯示在結(jié)直腸癌細(xì)胞中MUC2mRNA的表達受抑制,其發(fā)生機制與MUC2基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化相關(guān)。 細(xì)菌性腦膜炎是新生兒時期中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見最嚴(yán)重的感染。其中大腸埃希菌(E. coli) K1株是目前新生兒細(xì)菌性腦膜炎的首要致病菌.E. coli K1株在40%敗血癥或80%腦膜炎患兒中都可分離到,它主要源于母親腸道,孕婦因其特殊體質(zhì),腸道定殖的E. coli K1株容易易位于陰道,致使新生兒在通過產(chǎn)道時獲得感染。E. coli K1株一旦定植于新生兒腸道,0.5%可發(fā)生腸道侵襲性定位轉(zhuǎn)移而入血,并穿過血腦屏障而引發(fā)腦膜炎。所以調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡,抑制致病菌的腸道黏附侵襲,成為在孕婦階段預(yù)防本病發(fā)生的關(guān)鍵步驟。另外,新生兒腦膜炎的發(fā)生過程中,E. coli K1株首先定植于新生兒腸道,之后才會穿透腸屏障和血腦屏障,引起菌血癥和腦膜炎,所以預(yù)防E. coli K1株株穿透腸上皮入血,也成為有效預(yù)防其引發(fā)菌血癥和腦膜炎的關(guān)鍵環(huán)節(jié)�？股貜V泛應(yīng)用于感染性疾病的治療,細(xì)菌性腦膜炎仍然是新生兒高發(fā)病率和高死亡率的重要原因之一。各種抗生素的廣泛長期應(yīng)用,一方面使耐藥菌株增加,耐藥因子迅速擴散,另一方面引起腸道菌群絮亂,造成腸道功能失調(diào)。 益生菌是一類對宿主有益的活性微生物,是定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi),能產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱。益生菌對維持腸道微生態(tài)穩(wěn)定、降低胃腸道疾病的發(fā)病率、抑制病原微生物侵襲、對腹瀉疾病的預(yù)防、調(diào)節(jié)免疫防御方面有重要作用。體外研究證實,益生菌制劑抑制病原微生物黏附腸道上皮細(xì)胞,抑制作用是通過增加腸道黏液素MUC2、MUC3的表達為媒介。細(xì)菌上皮細(xì)胞黏附是多步驟的,首先是細(xì)菌與上皮細(xì)胞層的作用。益生菌通過加強腸內(nèi)黏液素的產(chǎn)生來阻止腸道病原菌的附著,附著能被抑制是空間障礙或者黏液素模仿上皮細(xì)胞的細(xì)菌結(jié)合位點而產(chǎn)生的競爭抑制.R.Mack等證實黏蛋白由腸上皮細(xì)胞分泌,阻擋致病蛋白EPEC接觸腸上皮細(xì)胞,避免EPEC黏附到腸上皮細(xì)胞。腸道黏液層的主要成分黏蛋白是一種高分子量的糖蛋白通過上皮細(xì)胞的許多器官合成和分泌的,其有調(diào)節(jié)免疫、保護腸道和預(yù)防致病菌損傷的作用。在不同黏蛋白基因中,MUC2是主要的回結(jié)腸黏蛋白,在小腸和大腸的杯狀細(xì)胞中表達,是結(jié)腸的主要分泌黏蛋白成分。腸道病原菌擁有了很多戰(zhàn)略來回避黏蛋白疊加上皮細(xì)胞。黏蛋白-病原體相互作用可能由上皮細(xì)胞黏蛋白的數(shù)量和質(zhì)量決定的。 目前對益生菌、致病菌和腸道黏蛋白基因表達之間的關(guān)系研究較少。MUC2在致病菌侵襲腸屏障中的作用機理仍不清楚。本研究通過構(gòu)建MUC2shRNA真核質(zhì)粒表達載體,利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞干擾MUC2基因表達,以了解黏蛋白MUC2基因沉默與E. coliK1株E44黏附侵襲腸屏障之間的關(guān)系；另一方面,通過去甲基化制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)預(yù)先處理Caco-2細(xì)胞,探討去甲基化制劑5-Aza-CdR誘導(dǎo)高甲基化失活的MUC2基因重新表達的可能性及其對大腸桿菌E44株黏附侵襲腸上皮細(xì)胞的影響,初步鑒定5-Aza-CdR與益生菌之間的作用關(guān)系,以了解益生菌和5-Aza-CdR在E. coli Kl株E44侵襲腸屏障中的具體機制,為研究MUC2基因在益生菌拮抗致病菌黏附侵襲腸上皮細(xì)胞中的作用及機制打下基礎(chǔ)。 二、研究方法 1、MUC2shRNA真核質(zhì)粒表達載體的構(gòu)建與鑒定 為了探討?zhàn)さ鞍譓UC2基因沉默與三聯(lián)活菌片中益生菌抑制大腸桿菌K1株E44黏附侵襲腸上皮作用之間的關(guān)系,設(shè)計合成4個靶向MUC2基因的可干擾序列,并設(shè)計一條經(jīng)BLAST檢索與現(xiàn)有基因文庫中所有人源基因均無同源性的非特異性序列為陰性對照序列。將合成的DNAOligo稀釋后退火形成shRNA雙鏈DNA,與pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒分別用Bbs Ⅰ、BamH I雙酶切后,以T4DNA連接酶進行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞,篩選后抽提質(zhì)粒,進行酶切和測序鑒定。 2、重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞 取測序正確的重組質(zhì)粒1.6gg和4.0μL脂質(zhì)體LipofectamineTM2000分別稀釋于100μLOpti-MEM中,室溫靜置5min；然后將兩者混合,室溫再放置20min,均勻加入培養(yǎng)孔內(nèi)6h后,更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。48h后,在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的綠色熒光情況,預(yù)測重組干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞的效率。 3、熒光定量PCR檢測MUC2基因干擾效率并篩選最有效的干擾序列 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,收集細(xì)胞,Trizol法抽提細(xì)胞總RNA。取2μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄后進行PCR反應(yīng),β-actin為內(nèi)參。實驗重復(fù)3次,通過2-△△Ct計算MUC2基因的相對表達量,以Caco-2細(xì)胞為對照細(xì)胞。根據(jù)熒光實時定量PCR結(jié)果,篩選出最有效抑制MUC2基因表達的干擾質(zhì)粒并用于后續(xù)實驗。 4、MUC2基因干擾后競爭性排斥法檢測益生菌對E. coli K1株黏附侵襲Caco-2細(xì)胞的影響 黏附和侵襲實驗采用競爭性排除法,將人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞株接種于24孔板中,細(xì)胞密度達80%～90%,用滅菌的PBS漂洗2次。黏附侵襲實驗步驟如前研究所述：每孔加108CFU益生菌與107CFU E44株共同孵育2.5h,對照組用等體積培養(yǎng)基代替益生菌與等量致病菌共同孵育。用培養(yǎng)基輕輕漂洗細(xì)胞3次,黏附實驗每孔加0.5%TritonX-100200μL,孵育8min裂解細(xì)胞,加入蒸餾水250gL,連續(xù)多次吹打并吸出樣品,倍比稀釋后涂布含利福平的瓊脂平板24h后計數(shù)菌落數(shù),實驗重復(fù)三次。侵襲實驗先用培養(yǎng)基(含慶大霉素終濃度為100μg/mL)孵育1h,以殺死細(xì)胞外細(xì)菌,之后實驗步驟按照黏附實驗的操作步驟,倍比稀釋后涂布含利福平的瓊脂平板24h后計數(shù)菌落數(shù),實驗重復(fù)三次。 5、去甲基化制劑5-Aza-CdR處理Caco-2細(xì)胞后MUC2基因的表達情況 去甲基化制劑5-Aza-CdR作用Caco-2細(xì)胞72h后,不同處理組細(xì)胞分別與益生菌、大腸桿菌E44孵育。收集各組不同處理的Caco-2細(xì)胞,用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA,該實驗操作按照Invitrogen/Trizol試劑盒說明書進行。紫外分光光度儀測定純度,A260/A280比值在1.80～1.90之間。取2μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄后進行熒光定量PCR反應(yīng),β-actin為內(nèi)參。每組重復(fù)3次,通過2-△△ct表示MUC2的相對表達量,以Caco-2細(xì)胞為對照細(xì)胞。 6、競爭性排斥方法檢測去甲基化制劑5-Aza-CdR對大腸桿菌E44黏附侵襲腸上皮的影響 實驗采用競爭性排除法,將人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞株接種于24孔板中,細(xì)胞密度達70%-80%,將去甲基化制劑5-Aza-CdR按5×10-6mol/L的濃度配制的培養(yǎng)液加到5-Aza-CdR+E44組、5-Aza-CdR+益生菌+E44組相應(yīng)培養(yǎng)孔中,分別在24h及48h后更換相同濃度的5-Aza-CdR培養(yǎng)液。以未加5-Aza-CdR干預(yù)的細(xì)胞為對照組,用等體積培養(yǎng)基代替5-Aza-CdR培養(yǎng)液,每組3個復(fù)孔。用滅菌的PBS漂洗2次。黏附實驗：每孔加108CFU益生菌與107CFUE44株到5-Aza-CdR+益生菌+E44組、益生菌+E44組中共同孵育2.5h,其他組用等體積培養(yǎng)基代替與等量致病菌共同孵育。侵襲實驗：每孔加108CFU的益生菌與107CFU E44株到5-Aza-CdR+益生菌+E44組、益生菌+E44組中共同孵育2.5h,其他組用等體積培養(yǎng)基代替與等量致病菌共同孵育。黏附侵襲實驗步驟如前研究所述。實驗重復(fù)3次。 三、結(jié)果 1、重組真核質(zhì)粒表達載體酶切鑒定和DNA測序結(jié)果 挑選單克隆菌株,接種到含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,震蕩過夜,按質(zhì)粒小量抽提步驟抽提質(zhì)粒,所得質(zhì)粒用BamH I、Pst I分別酶切鑒定。陽性重組質(zhì)粒應(yīng)該可以被BamH I切開,而不能被Pst Ⅰ切開。單酶切結(jié)果顯示,所有重組體均為陽性重組質(zhì)粒,從每組平板中挑選兩個典型克隆進行測序鑒定。經(jīng)引物測序后,測序結(jié)果和設(shè)計的shRNA堿基序列完全一致,證明該退火后合成的片段已經(jīng)完整的插入了質(zhì)粒之中而且沒有單個堿基的突變,成功的構(gòu)建了實驗所需要的重組質(zhì)粒。 2、脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞并間接估計轉(zhuǎn)染效率 脂質(zhì)體法RNAi MUC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞24h后,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光數(shù),通過計數(shù)同一視野光鏡下細(xì)胞總數(shù)及熒光顯微鏡下帶有綠色熒光細(xì)胞個數(shù),計算帶有綠色熒光細(xì)胞的百分比,即轉(zhuǎn)染效率=(綠色熒光細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù))×100%。本實驗轉(zhuǎn)染效率約為75%-85%。 3、 MUC2基因mRNA表達的變化 重組質(zhì)粒(RNAi MUC2)轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞48h后,提取細(xì)胞總RNA進行檢測,其對Caco-2細(xì)胞中MUC2mRNA的抑制情況如RT-qPCR結(jié)果顯示。通過相對定量方法2-△△Ct來檢測MUC2基因的干擾效率。 在設(shè)置的六組試驗中,RNAi MUC2-1-4實驗組的MUC2基因相對表達率分別為0.38、0.59、1.08、0.46,與空白組(Mock Control)比較,RNAi MUC2-1、RNAiMUC2-4有顯著差異,其干擾效率為62%和54%；陰性對照組RNAi NC的MUC2基因相對表達率與空白對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。在以后的實驗中將選用RNAiMUC2-1質(zhì)粒進行靶向MUC2基因功能抑制。 4、MUC2基因沉默后,益生菌對大腸桿菌E44黏附侵襲腸上皮細(xì)胞的抑制作用 采用競爭排斥實驗方法來檢測MUC2基因干擾前后益生菌干擾E44黏附侵襲Caco-2細(xì)胞的效果。以干擾前E44黏附侵襲率作為100%,以此標(biāo)化益生菌共同孵育時E44的相對黏附侵襲率,MUC2基因干擾前,益生菌明顯抑制致病菌黏附侵襲Caco-2細(xì)胞(P0.01),E44相對黏附率為14.36%,E44相對侵襲率為22.55%；MUC2基因干擾后,加益生菌共同孵育組與E44組相比,E44對腸上皮的黏附侵襲作用明顯提高,E44相對粘附率為63.64%,E44相對侵襲率為70.33%。細(xì)菌黏附侵襲實驗證明干擾MUC2基因后益生菌抑制E44黏附侵襲Caco-2細(xì)胞的作用顯著降低(P0.01)。 5、去甲基化制劑5-Aza-CdR處理前后MUC2基因mRNA的表達 結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞經(jīng)5×10-6mol/L5-Aza-CdR處理后,MUC2基因的mRNA重新表達(P0.01),結(jié)果與益生菌組一致,E44組MUC2基因表達較對照組明顯降低(P0.01),而5-Aza-CdR+E44組、5-Aza-CdR+益生菌+E44組、益生菌+E44組與對照組相比沒有明顯差異。 6、去甲基化制劑5-Aza-CdR對大腸桿菌E44黏附侵襲Caco-2細(xì)胞的影響 加去甲基化制劑5-Aza-CdR處理Caco-2細(xì)胞72h后,采用競爭性排斥法將益生菌、大腸桿菌E44株與Caco-2細(xì)胞共孵育,檢測去甲基化制劑5-Aza-CdR和益生菌拮抗大腸桿菌E44株黏附侵襲Caco-2細(xì)胞的效果。以對照組E44黏附侵襲率作為100%,以此標(biāo)化5-Aza-CdR處理組和益生菌共同孵育組E44的相對黏附侵襲率,加去甲基化制劑5-Aza-CdR處理后,明顯降低致病菌E44黏附侵襲Caco-2細(xì)胞(P0.05),E44相對黏附率為10.33%,E44相對侵襲率為29.45%;益生菌作用效果與5-Aza-CdR相似,與對照組相比,益生菌組E44相對黏附率為11.70%,相對侵襲率為33.43(P0.05)。 四、結(jié)論 1、shRNA真核質(zhì)粒介導(dǎo)的RNA干擾可明顯抑制Caco-2細(xì)胞MUC2基因的表達； 2、MUC2基因沉默后,益生菌對E44黏附侵襲腸上皮細(xì)胞的抑制作用明顯降低； 3、去甲基化制劑5-Aza-CdR能夠逆轉(zhuǎn)MUC2基因甲基化狀態(tài),調(diào)控MUC2基因重新表達； 4、去甲基化制劑5-Aza-CdR能夠有效抑制大腸桿菌E44株黏附侵襲腸上皮細(xì)胞,其作用效果與益生菌相似。
【關(guān)鍵詞】：MUC2基因 RNA干擾 E. coli K1株E44 黏附與侵襲 5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-CdR) DNA甲基化
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378.2
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-24
• 第一章 MUC2 shRNA真核質(zhì)粒表達載體的構(gòu)建與鑒定24-40
• 1.1 材料25-28
• 1.2 方法28-36
• 1.3 結(jié)果36-38
• 1.4 討論38-40
• 第二章 MUC2基因沉默與益生菌抑制E.coli K1株黏附侵襲腸上皮細(xì)胞的關(guān)系40-59
• 2.1 材料41-43
• 2.2 方法43-50
• 2.3 結(jié)果50-56
• 2.4 討論56-59
• 第三章 MUC2基因甲基化與益生菌抑制E.coli K1株黏附侵襲腸上皮細(xì)胞的關(guān)系59-70
• 3.1 材料59-61
• 3.2 方法61-64
• 3.3 結(jié)果64-68
• 3.4 討論68-70
• 全文總結(jié)70-73
• 參考文獻73-79
• 英文縮略詞表79-80
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文80-81
• 致謝81-82

【參考文獻】

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1 顧婷婷,喬繼英,楊s，

本文編號：413870