本文關鍵詞：MUC2基因表達與益生菌抑制大腸桿菌K1株黏附侵襲腸上皮細胞的關系研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一、研究背景 黏蛋白(Mucin)是由體內多種上皮細胞分泌的大分子量糖蛋白。根據其結構的不同可分為分泌型和膜結合型。在正常情況下,黏蛋白除了對上皮細胞組織起保護作用外,還參與上皮細胞的分類和更新,細胞黏附和細胞信號傳導通路的調節(jié)等。在病理狀態(tài)下,黏蛋白在惡性腫瘤及癌病變中的表達發(fā)生異常。MUC2屬于分泌型黏蛋白,在結腸、小腸及呼吸道上皮細胞中均有表達。該蛋白質在腸道的表面形成一層粘液層發(fā)揮潤滑和拮抗致病菌的腸道黏附和侵襲的作用。在正常情況下,MUC2100%表達于腸道粘膜上皮,而在大腸腫瘤中表達降低。目前已在多種上皮來源的腫瘤及腸道疾病中發(fā)現(xiàn)黏蛋白的結構及功能發(fā)生改變,出現(xiàn)黏蛋白的異常表達,其異常表達與臨床預后相關。Ho等研究顯示MUC2的異常表達與其啟動子高甲基化相關,并且已有研究顯示在結直腸癌細胞中MUC2mRNA的表達受抑制,其發(fā)生機制與MUC2基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化相關。 細菌性腦膜炎是新生兒時期中樞神經系統(tǒng)最常見最嚴重的感染。其中大腸埃希菌(E. coli) K1株是目前新生兒細菌性腦膜炎的首要致病菌.E. coli K1株在40%敗血癥或80%腦膜炎患兒中都可分離到,它主要源于母親腸道,孕婦因其特殊體質,腸道定殖的E. coli K1株容易易位于陰道,致使新生兒在通過產道時獲得感染。E. coli K1株一旦定植于新生兒腸道,0.5%可發(fā)生腸道侵襲性定位轉移而入血,并穿過血腦屏障而引發(fā)腦膜炎。所以調節(jié)腸道微生態(tài)平衡,抑制致病菌的腸道黏附侵襲,成為在孕婦階段預防本病發(fā)生的關鍵步驟。另外,新生兒腦膜炎的發(fā)生過程中,E. coli K1株首先定植于新生兒腸道,之后才會穿透腸屏障和血腦屏障,引起菌血癥和腦膜炎,所以預防E. coli K1株株穿透腸上皮入血,也成為有效預防其引發(fā)菌血癥和腦膜炎的關鍵環(huán)節(jié)。抗生素廣泛應用于感染性疾病的治療,細菌性腦膜炎仍然是新生兒高發(fā)病率和高死亡率的重要原因之一。各種抗生素的廣泛長期應用,一方面使耐藥菌株增加,耐藥因子迅速擴散,另一方面引起腸道菌群絮亂,造成腸道功能失調。 益生菌是一類對宿主有益的活性微生物,是定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內,能產生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱。益生菌對維持腸道微生態(tài)穩(wěn)定、降低胃腸道疾病的發(fā)病率、抑制病原微生物侵襲、對腹瀉疾病的預防、調節(jié)免疫防御方面有重要作用。體外研究證實,益生菌制劑抑制病原微生物黏附腸道上皮細胞,抑制作用是通過增加腸道黏液素MUC2、MUC3的表達為媒介。細菌上皮細胞黏附是多步驟的,首先是細菌與上皮細胞層的作用。益生菌通過加強腸內黏液素的產生來阻止腸道病原菌的附著,附著能被抑制是空間障礙或者黏液素模仿上皮細胞的細菌結合位點而產生的競爭抑制.R.Mack等證實黏蛋白由腸上皮細胞分泌,阻擋致病蛋白EPEC接觸腸上皮細胞,避免EPEC黏附到腸上皮細胞。腸道黏液層的主要成分黏蛋白是一種高分子量的糖蛋白通過上皮細胞的許多器官合成和分泌的,其有調節(jié)免疫、保護腸道和預防致病菌損傷的作用。在不同黏蛋白基因中,MUC2是主要的回結腸黏蛋白,在小腸和大腸的杯狀細胞中表達,是結腸的主要分泌黏蛋白成分。腸道病原菌擁有了很多戰(zhàn)略來回避黏蛋白疊加上皮細胞。黏蛋白-病原體相互作用可能由上皮細胞黏蛋白的數量和質量決定的。 目前對益生菌、致病菌和腸道黏蛋白基因表達之間的關系研究較少。MUC2在致病菌侵襲腸屏障中的作用機理仍不清楚。本研究通過構建MUC2shRNA真核質粒表達載體,利用脂質體LipofectamineTM2000轉染人結腸癌Caco-2細胞干擾MUC2基因表達,以了解黏蛋白MUC2基因沉默與E. coliK1株E44黏附侵襲腸屏障之間的關系；另一方面,通過去甲基化制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)預先處理Caco-2細胞,探討去甲基化制劑5-Aza-CdR誘導高甲基化失活的MUC2基因重新表達的可能性及其對大腸桿菌E44株黏附侵襲腸上皮細胞的影響,初步鑒定5-Aza-CdR與益生菌之間的作用關系,以了解益生菌和5-Aza-CdR在E. coli Kl株E44侵襲腸屏障中的具體機制,為研究MUC2基因在益生菌拮抗致病菌黏附侵襲腸上皮細胞中的作用及機制打下基礎。 二、研究方法 1、MUC2shRNA真核質粒表達載體的構建與鑒定 為了探討?zhàn)さ鞍譓UC2基因沉默與三聯(lián)活菌片中益生菌抑制大腸桿菌K1株E44黏附侵襲腸上皮作用之間的關系,設計合成4個靶向MUC2基因的可干擾序列,并設計一條經BLAST檢索與現(xiàn)有基因文庫中所有人源基因均無同源性的非特異性序列為陰性對照序列。將合成的DNAOligo稀釋后退火形成shRNA雙鏈DNA,與pGPU6/GFP/Neo質粒分別用Bbs Ⅰ、BamH I雙酶切后,以T4DNA連接酶進行連接,連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞,篩選后抽提質粒,進行酶切和測序鑒定。 2、重組質粒瞬時轉染人結腸癌Caco-2細胞 取測序正確的重組質粒1.6gg和4.0μL脂質體LipofectamineTM2000分別稀釋于100μLOpti-MEM中,室溫靜置5min；然后將兩者混合,室溫再放置20min,均勻加入培養(yǎng)孔內6h后,更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。48h后,在倒置熒光顯微鏡下觀察轉染細胞的綠色熒光情況,預測重組干擾質粒轉染Caco-2細胞的效率。 3、熒光定量PCR檢測MUC2基因干擾效率并篩選最有效的干擾序列 細胞轉染48h后,收集細胞,Trizol法抽提細胞總RNA。取2μg總RNA進行逆轉錄后進行PCR反應,β-actin為內參。實驗重復3次,通過2-△△Ct計算MUC2基因的相對表達量,以Caco-2細胞為對照細胞。根據熒光實時定量PCR結果,篩選出最有效抑制MUC2基因表達的干擾質粒并用于后續(xù)實驗。 4、MUC2基因干擾后競爭性排斥法檢測益生菌對E. coli K1株黏附侵襲Caco-2細胞的影響 黏附和侵襲實驗采用競爭性排除法,將人結腸癌Caco-2細胞株接種于24孔板中,細胞密度達80%～90%,用滅菌的PBS漂洗2次。黏附侵襲實驗步驟如前研究所述：每孔加108CFU益生菌與107CFU E44株共同孵育2.5h,對照組用等體積培養(yǎng)基代替益生菌與等量致病菌共同孵育。用培養(yǎng)基輕輕漂洗細胞3次,黏附實驗每孔加0.5%TritonX-100200μL,孵育8min裂解細胞,加入蒸餾水250gL,連續(xù)多次吹打并吸出樣品,倍比稀釋后涂布含利福平的瓊脂平板24h后計數菌落數,實驗重復三次。侵襲實驗先用培養(yǎng)基(含慶大霉素終濃度為100μg/mL)孵育1h,以殺死細胞外細菌,之后實驗步驟按照黏附實驗的操作步驟,倍比稀釋后涂布含利福平的瓊脂平板24h后計數菌落數,實驗重復三次。 5、去甲基化制劑5-Aza-CdR處理Caco-2細胞后MUC2基因的表達情況 去甲基化制劑5-Aza-CdR作用Caco-2細胞72h后,不同處理組細胞分別與益生菌、大腸桿菌E44孵育。收集各組不同處理的Caco-2細胞,用Trizol試劑提取各組細胞總RNA,該實驗操作按照Invitrogen/Trizol試劑盒說明書進行。紫外分光光度儀測定純度,A260/A280比值在1.80～1.90之間。取2μg總RNA進行逆轉錄后進行熒光定量PCR反應,β-actin為內參。每組重復3次,通過2-△△ct表示MUC2的相對表達量,以Caco-2細胞為對照細胞。 6、競爭性排斥方法檢測去甲基化制劑5-Aza-CdR對大腸桿菌E44黏附侵襲腸上皮的影響 實驗采用競爭性排除法,將人結腸癌Caco-2細胞株接種于24孔板中,細胞密度達70%-80%,將去甲基化制劑5-Aza-CdR按5×10-6mol/L的濃度配制的培養(yǎng)液加到5-Aza-CdR+E44組、5-Aza-CdR+益生菌+E44組相應培養(yǎng)孔中,分別在24h及48h后更換相同濃度的5-Aza-CdR培養(yǎng)液。以未加5-Aza-CdR干預的細胞為對照組,用等體積培養(yǎng)基代替5-Aza-CdR培養(yǎng)液,每組3個復孔。用滅菌的PBS漂洗2次。黏附實驗：每孔加108CFU益生菌與107CFUE44株到5-Aza-CdR+益生菌+E44組、益生菌+E44組中共同孵育2.5h,其他組用等體積培養(yǎng)基代替與等量致病菌共同孵育。侵襲實驗：每孔加108CFU的益生菌與107CFU E44株到5-Aza-CdR+益生菌+E44組、益生菌+E44組中共同孵育2.5h,其他組用等體積培養(yǎng)基代替與等量致病菌共同孵育。黏附侵襲實驗步驟如前研究所述。實驗重復3次。 三、結果 1、重組真核質粒表達載體酶切鑒定和DNA測序結果 挑選單克隆菌株,接種到含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,震蕩過夜,按質粒小量抽提步驟抽提質粒,所得質粒用BamH I、Pst I分別酶切鑒定。陽性重組質粒應該可以被BamH I切開,而不能被Pst Ⅰ切開。單酶切結果顯示,所有重組體均為陽性重組質粒,從每組平板中挑選兩個典型克隆進行測序鑒定。經引物測序后,測序結果和設計的shRNA堿基序列完全一致,證明該退火后合成的片段已經完整的插入了質粒之中而且沒有單個堿基的突變,成功的構建了實驗所需要的重組質粒。 2、脂質體介導法轉染Caco-2細胞并間接估計轉染效率 脂質體法RNAi MUC2質粒轉染Caco-2細胞24h后,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光數,通過計數同一視野光鏡下細胞總數及熒光顯微鏡下帶有綠色熒光細胞個數,計算帶有綠色熒光細胞的百分比,即轉染效率=(綠色熒光細胞數／總細胞數)×100%。本實驗轉染效率約為75%-85%。 3、 MUC2基因mRNA表達的變化 重組質粒(RNAi MUC2)轉染Caco-2細胞48h后,提取細胞總RNA進行檢測,其對Caco-2細胞中MUC2mRNA的抑制情況如RT-qPCR結果顯示。通過相對定量方法2-△△Ct來檢測MUC2基因的干擾效率。 在設置的六組試驗中,RNAi MUC2-1-4實驗組的MUC2基因相對表達率分別為0.38、0.59、1.08、0.46,與空白組(Mock Control)比較,RNAi MUC2-1、RNAiMUC2-4有顯著差異,其干擾效率為62%和54%；陰性對照組RNAi NC的MUC2基因相對表達率與空白對照組相比無統(tǒng)計學差異。在以后的實驗中將選用RNAiMUC2-1質粒進行靶向MUC2基因功能抑制。 4、MUC2基因沉默后,益生菌對大腸桿菌E44黏附侵襲腸上皮細胞的抑制作用 采用競爭排斥實驗方法來檢測MUC2基因干擾前后益生菌干擾E44黏附侵襲Caco-2細胞的效果。以干擾前E44黏附侵襲率作為100%,以此標化益生菌共同孵育時E44的相對黏附侵襲率,MUC2基因干擾前,益生菌明顯抑制致病菌黏附侵襲Caco-2細胞(P0.01),E44相對黏附率為14.36%,E44相對侵襲率為22.55%；MUC2基因干擾后,加益生菌共同孵育組與E44組相比,E44對腸上皮的黏附侵襲作用明顯提高,E44相對粘附率為63.64%,E44相對侵襲率為70.33%。細菌黏附侵襲實驗證明干擾MUC2基因后益生菌抑制E44黏附侵襲Caco-2細胞的作用顯著降低(P0.01)。 5、去甲基化制劑5-Aza-CdR處理前后MUC2基因mRNA的表達 結腸癌細胞系Caco-2細胞經5×10-6mol/L5-Aza-CdR處理后,MUC2基因的mRNA重新表達(P0.01),結果與益生菌組一致,E44組MUC2基因表達較對照組明顯降低(P0.01),而5-Aza-CdR+E44組、5-Aza-CdR+益生菌+E44組、益生菌+E44組與對照組相比沒有明顯差異。 6、去甲基化制劑5-Aza-CdR對大腸桿菌E44黏附侵襲Caco-2細胞的影響 加去甲基化制劑5-Aza-CdR處理Caco-2細胞72h后,采用競爭性排斥法將益生菌、大腸桿菌E44株與Caco-2細胞共孵育,檢測去甲基化制劑5-Aza-CdR和益生菌拮抗大腸桿菌E44株黏附侵襲Caco-2細胞的效果。以對照組E44黏附侵襲率作為100%,以此標化5-Aza-CdR處理組和益生菌共同孵育組E44的相對黏附侵襲率,加去甲基化制劑5-Aza-CdR處理后,明顯降低致病菌E44黏附侵襲Caco-2細胞(P0.05),E44相對黏附率為10.33%,E44相對侵襲率為29.45%;益生菌作用效果與5-Aza-CdR相似,與對照組相比,益生菌組E44相對黏附率為11.70%,相對侵襲率為33.43(P0.05)。 四、結論 1、shRNA真核質粒介導的RNA干擾可明顯抑制Caco-2細胞MUC2基因的表達； 2、MUC2基因沉默后,益生菌對E44黏附侵襲腸上皮細胞的抑制作用明顯降低； 3、去甲基化制劑5-Aza-CdR能夠逆轉MUC2基因甲基化狀態(tài),調控MUC2基因重新表達； 4、去甲基化制劑5-Aza-CdR能夠有效抑制大腸桿菌E44株黏附侵襲腸上皮細胞,其作用效果與益生菌相似。
【關鍵詞】：MUC2基因 RNA干擾 E. coli K1株E44 黏附與侵襲 5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-CdR) DNA甲基化
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378.2
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-24
• 第一章 MUC2 shRNA真核質粒表達載體的構建與鑒定24-40
• 1.1 材料25-28
• 1.2 方法28-36
• 1.3 結果36-38
• 1.4 討論38-40
• 第二章 MUC2基因沉默與益生菌抑制E.coli K1株黏附侵襲腸上皮細胞的關系40-59
• 2.1 材料41-43
• 2.2 方法43-50
• 2.3 結果50-56
• 2.4 討論56-59
• 第三章 MUC2基因甲基化與益生菌抑制E.coli K1株黏附侵襲腸上皮細胞的關系59-70
• 3.1 材料59-61
• 3.2 方法61-64
• 3.3 結果64-68
• 3.4 討論68-70
• 全文總結70-73
• 參考文獻73-79
• 英文縮略詞表79-80
• 攻讀學位期間發(fā)表論文80-81
• 致謝81-82

【參考文獻】

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1 顧婷婷,喬繼英,楊s，

本文編號：413870