本文關(guān)鍵詞：菌影疫苗和淋病奈瑟菌疫苗的制備及其免疫原性初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細(xì)菌菌影(bacterial ghosts, BGs)是革蘭陰性菌在噬菌體PhiX174的裂解蛋白E的作用下形成的不含核酸、核糖體及其他組分的細(xì)菌空殼。BGs在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上與天然細(xì)菌保持良好的一致性,菌體表面的脂多糖、肽聚糖等成分可作為天然佐劑,菌影的胞周間隙和細(xì)胞空殼內(nèi)部可接受大量的外源物質(zhì)((?)DNA、藥物等),細(xì)菌菌影不僅可直接作為疫苗使用,而且可作為運(yùn)送疫苗和藥物的載體。 淋病(Gonorrhea)是由淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)引起的性傳播疾病。隨著淋病奈瑟菌耐藥菌株日趨增加,抗生素的治療效果降低或喪失,治療成本也大大增加。新型疫苗的研制對預(yù)防和控制淋病傳播流行具有重要意義。 本課題起初設(shè)計(jì)是借助菌影這種新型載體,裝載淋病奈瑟菌基因疫苗,但由于裝載效率需要進(jìn)一步完善,在此先探索了大腸桿菌和沙門氏菌菌影的制備方法,同時構(gòu)建了減毒沙門氏菌介導(dǎo)的淋病奈瑟菌基因疫苗,并分別對其免疫原性進(jìn)行了初步研究,為以后淋病疫苗的研制探路。 研究內(nèi)容分為以下三部分： 一、大腸桿菌菌影的制備 以噬菌體PhiX174為模板,通過PCR擴(kuò)增出裂解基因E和Em,將裂解基因分別插入到含有λpL/pR-cI857調(diào)控系統(tǒng)的pBV220和pBV220m載體中。本部分共構(gòu)建了四個重組溶菌質(zhì)粒,分別命名為pBV220-E、pBV220m-E、pBV220-Em和pBV220m-Em。經(jīng)42℃熱誘導(dǎo)表達(dá)裂解基因,pBV220-Em裂解效率最高,達(dá)到99%；掃描電鏡和透射電鏡結(jié)果顯示,細(xì)菌表面有孔,細(xì)菌內(nèi)容物清空形成空殼,表明已成功制備了具有完整外膜的大腸桿菌菌影。將真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1裝載菌影后轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)染效率不高,方法有待改進(jìn)。 二、沙門氏菌菌影的制備及其免疫原性初步研究 以溶菌質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增溫控溶菌盒(EBOX1/EBOX2),用限制性內(nèi)切酶(XhoI、Spe Ⅰ)酶切后重組到pBBR1MCS2載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中。通過電轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入沙門氏菌HA2中,獲得的重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá),pBBR1MCS2-EBOX2裂解效率達(dá)到98.67%。掃描電鏡和透射電鏡結(jié)果顯示,腸炎沙門氏菌內(nèi)容物流失形成菌影。 將6-8周齡的BALB/c小鼠,隨機(jī)分成3組：沙門氏菌HA2菌影組(HA2-BG組)、沙門氏菌HA2滅活菌組、PBS對照組。HA2-BG組和PBS組通過口服和滴鼻免疫,HA2滅活菌組以肌肉注射的方式免疫,每兩周免疫一次,共免疫3次。間接ELISA檢測血清中IgG和糞便中IgA水平。結(jié)果表明,二免兩周后,HA2-BG組和HA2滅活菌組血清中IgG含量顯著高于PBS組(P0.05),三免兩周后,達(dá)到極顯著(P0.01)；HA2-BG組糞便中IgA含量在整個免疫期間均顯著高于HA2滅活菌組和PBS組。說明沙門氏菌菌影具有良好的免疫原性,可激發(fā)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答和局部的黏膜免疫應(yīng)答。 三、減毒沙門氏菌介導(dǎo)淋病奈瑟菌DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫原性初步研究 以淋病奈瑟菌WHO-A株基因組DNA為模板分別擴(kuò)增NspA基因和PorB基因,將克隆的NspA基因和PorB基因分別與pVAX1載體連接,成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-NspA和pVAX1-PorB。將重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,RT-PCR和間接免疫熒光試驗(yàn)可檢測出NspA基因和PorB基因在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)。將重組真核表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化減毒沙門氏菌SL7207,建出重組沙門氏菌SL7207(pVAX1-NspA)和SL7207(pVAX1-PorB)。將6-8周齡的BALB/c小鼠隨機(jī)分為五組：SL7207(pVAX1-NspA)組、SL7207(pVAX1-PorB)組、SL7207(pVAX1-NspA)+SL7207(pVAX1-PorB)組、SL7207(pVAX1)組和PBS組,每組滴鼻口服免疫1×109CFU,間接ELISA檢測抗體。結(jié)果顯示,各重組菌SL7207(pVAX1-NspA)組、SL7207(pVAX1-PorB)組、SL7207(pVAX1-NspA)+SL7207(pVAXl-PorB)組在一免兩周后就能檢測到血清中IgG和糞便中IgA抗體,二免和三免后,其抗體水平均顯著高于SL7207(pVAXl)組和PBS組。說明減毒沙門氏菌介導(dǎo)的淋病奈瑟菌基因疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和黏膜免疫應(yīng)答。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)菌菌影 淋病奈瑟菌 DNA疫苗 免疫原性
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 符號說明9-11
• 研究內(nèi)容一 大腸桿菌菌影的構(gòu)建11-27
• 1. 材料和方法11-18
• 2. 結(jié)果18-24
• 3. 討論24-25
• 參考文獻(xiàn)25-27
• 研究內(nèi)容二 腸炎沙門氏菌菌影的制備及其免疫原性初步研究27-40
• 1. 材料和方法27-31
• 2. 結(jié)果31-36
• 3. 討論36-38
• 參考文獻(xiàn)38-40
• 研究內(nèi)容三 減毒沙門氏菌介導(dǎo)淋病奈瑟菌DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫原性初步研究40-53
• 1. 材料和方法40-46
• 2. 結(jié)果46-50
• 3. 討論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-53
• 綜述一 細(xì)菌菌影的研究進(jìn)展53-61
• 參考文獻(xiàn)58-61
• 綜述二 淋病的研究進(jìn)展61-67
• 參考文獻(xiàn)64-67
• 致謝67-68

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 季明春,陳紅菊;奈瑟氏淋球菌表面蛋白A基因克隆及在真核細(xì)胞中的表達(dá)研究[J];微生物學(xué)報(bào);2004年01期

2 譚昭,諶貽璞;淋病奈瑟菌性尿道炎[J];新醫(yī)學(xué);2002年11期

3 李小妹;馬躍;李安興;謝明權(quán);張嘵瑜;;禽致病性大腸桿菌(APEC)菌蛻的制備研究[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2007年06期

  本文關(guān)鍵詞：菌影疫苗和淋病奈瑟菌疫苗的制備及其免疫原性初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：407073