本文關(guān)鍵詞：三種生物恐怖因子重組優(yōu)勢(shì)抗原表位融合蛋白的表達(dá)、純化及活性鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：生物恐怖活動(dòng)由于對(duì)人群的普遍易感性、不可預(yù)見(jiàn)性以及強(qiáng)大的殺傷力，已日益引起世界各國(guó)的廣泛關(guān)注。目前，全世界至少有15個(gè)國(guó)家和地區(qū)可能有生物戰(zhàn)計(jì)劃，主要集中在我國(guó)周邊地區(qū)。因此，研制針對(duì)生物恐怖戰(zhàn)劑的快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)試劑與方法十分必要。膠體金免疫層析法（GICA）具有快速、簡(jiǎn)便，且不需專門(mén)專業(yè)技術(shù)人員操作等優(yōu)點(diǎn)，，現(xiàn)已成為生物恐怖檢測(cè)方法的研究熱點(diǎn)；而膠體金免疫層析法的高靈敏度和特異度主要取決于抗原的設(shè)計(jì)和表達(dá)。 方法：本研究選取三種常見(jiàn)的生物恐怖因子：布氏桿菌、炭疽桿菌和肉毒毒素作為研究對(duì)象，通過(guò)查詢NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和相關(guān)文獻(xiàn)資料選取布氏桿菌、炭疽桿菌和肉毒毒素的B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，加入酶切位點(diǎn)、His-tag標(biāo)簽以及l(fā)inker，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好基因進(jìn)行優(yōu)化，并轉(zhuǎn)入pET-20b原核表達(dá)載體構(gòu)建重組布氏桿菌外膜蛋白抗原表達(dá)載體（pET-20b-rOmp）、重組炭疽桿菌保護(hù)性抗原表達(dá)載體（pET-20b-rPA）、重組肉毒毒素重鏈抗原表達(dá)載體（pET-20b-rHc）。通過(guò)設(shè)置不同濃度的IPTG及誘導(dǎo)時(shí)間，確定三種蛋白的最優(yōu)表達(dá)條件；經(jīng)過(guò)超聲破碎、尿素溶解并采用SDS-PAGE鑒定，鑒定其表達(dá)形式；采用鎳離子親和層析法對(duì)于目的蛋白進(jìn)行純化，并應(yīng)用SDS-PAGE以及Western blot法進(jìn)行鑒定，采用Western blot法鑒定三種融合蛋白的生物學(xué)活性。 結(jié)果：成功構(gòu)建了pET-20b-rOmp、pET-20b-rPA和pET-20b-rHc三種原核表達(dá)載體；三種蛋白的最優(yōu)表達(dá)條件為IPTG濃度為1mM，誘導(dǎo)時(shí)間為4h；三種蛋白均為包涵體表達(dá)，純化后三種蛋白均具有較高純度，western blot法鑒定，三種蛋白分別能夠與布氏桿菌單克隆抗體、炭疽沉淀素抗體和肉毒毒素診斷血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明三種重組抗原在工程菌中獲得正確表達(dá)，并具有良好的生物學(xué)活性。 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建并表達(dá)了三種生物恐怖因子的優(yōu)勢(shì)抗原融合蛋白，具有良好的免疫學(xué)特性，為進(jìn)一步研制三種生物恐怖因子膠體金免疫層析法同步快速檢測(cè)試紙條奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：生物恐怖因子 布氏桿菌 炭疽桿菌 肉毒毒素 原核表達(dá) 親和層析 活性鑒定
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392.1
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 第1章 緒論10-20
• 1.1 生物恐怖概述10-11
• 1.1.1 生物恐怖10
• 1.1.2 生物恐怖因子10-11
• 1.2 布氏桿菌研究進(jìn)展11-14
• 1.2.1 布氏桿菌概述11
• 1.2.2 布氏桿菌外膜蛋白研究進(jìn)展11-13
• 1.2.3 布氏桿菌檢測(cè)方法研究進(jìn)展13-14
• 1.3 炭疽桿菌研究進(jìn)展14-16
• 1.3.1 炭疽桿菌概述14
• 1.3.2 炭疽桿菌抗原研究進(jìn)展14-15
• 1.3.3 炭疽桿菌檢測(cè)方法研究進(jìn)展15-16
• 1.4 肉毒毒素研究進(jìn)展16-19
• 1.4.1 肉毒毒素概述16-17
• 1.4.2 肉毒毒素的結(jié)構(gòu)17
• 1.4.3 肉毒毒素檢測(cè)方法研究進(jìn)展17-19
• 1.5 論文研究目的與意義19-20
• 第2章 材料與方法20-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器20-22
• 2.1.1 主要材料20
• 2.1.2 主要儀器20-21
• 2.1.3 試劑配制21-22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-31
• 2.2.1 布氏桿菌、炭疽桿菌和肉毒毒素主要優(yōu)勢(shì)抗原表位的選取22-23
• 2.2.2 重組布氏桿菌原核載體（pET-20b-rOmp）、重組炭疽桿菌原核表達(dá)載體（pET-20b-rPA）、重組肉毒毒素原核表達(dá)載體（pET-20b-rHc）的構(gòu)建23-25
• 2.2.3 原核表達(dá)載體 pET-20b-rOmp、pET-20b-rPA 和pET-20b-rHc 的鑒定25
• 2.2.4 重組布氏桿菌主要優(yōu)勢(shì)抗原融合蛋白（rOmp）、炭疽桿菌主要優(yōu)勢(shì)抗原融合蛋白（rPA）和肉毒毒素主要優(yōu)勢(shì)抗原融合蛋白（rHc）的原核表達(dá)25-28
• 2.2.5 western blot 法鑒定重組融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 的誘導(dǎo)表達(dá)28-29
• 2.2.6 重組融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 的純化29-30
• 2.2.7 Western blot 法鑒定純化的重組融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 的生物學(xué)活性30-31
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-49
• 3.1 布氏桿菌、炭疽桿菌和肉毒毒素主要優(yōu)勢(shì)抗原表位的選取31-32
• 3.2 原核表達(dá)載體 pET-20b-rOmp、pET-20b-rPA 和 pET-20b-rHc 的鑒定32-38
• 3.3 重組融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 最優(yōu)表達(dá)條件的確定38-41
• 3.4 western blot 法鑒定重組融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 的誘導(dǎo)表達(dá)41-43
• 3.5 重組融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 表達(dá)形式的確定43-45
• 3.6 重組融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 的純化45-47
• 3.7 Western blot 法鑒定純化的重組融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc的生物學(xué)活性47-49
• 第4章 討論49-52
• 第5章 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 作者簡(jiǎn)介60-61
• 致謝61

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 劉艷華;賈揚(yáng);王景林;;E型肉毒神經(jīng)毒素(BoNT)基因序列分析及其B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2006年05期

2 王景林,楊瑞馥;重要生物恐怖病原及其醫(yī)學(xué)防護(hù)對(duì)策[J];生物技術(shù)通訊;2003年01期

3 楊秀清,蔭俊;肉毒毒素結(jié)構(gòu)及其重組疫苗的相關(guān)研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通訊;2005年02期

4 左庭婷;肉毒毒素的中毒和檢測(cè)方法[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2003年02期

5 朱明東;徐衛(wèi)民;洪林娣;金行一;施曉華;楊洋;;斑點(diǎn)金免疫滲濾法快速診斷布魯桿菌病的研究[J];中國(guó)地方病學(xué)雜志;2006年03期

  本文關(guān)鍵詞：三種生物恐怖因子重組優(yōu)勢(shì)抗原表位融合蛋白的表達(dá)、純化及活性鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：406388