本文關(guān)鍵詞：微小隱孢子蟲部分含TSP1結(jié)構(gòu)域蛋白對上皮細(xì)胞的粘附特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隱孢子蟲（Cryptosporidium）是世界范圍內(nèi)醫(yī)療界和獸醫(yī)界公認(rèn)的重要腸道寄生蟲，可以導(dǎo)致人類和動物的隱孢子蟲病。其中微小隱孢子蟲（C.parvum）的感染對人畜健康威脅最大。該病在健康人群中引起自限性腹瀉疾病，但免疫缺陷的人群感染該病后病情嚴(yán)重甚至危及生命。目前研制開發(fā)相關(guān)抗體和疫苗的阻礙主要在于缺少對微小隱孢子蟲致病機理的了解。 宿主細(xì)胞表面受體和寄生蟲表面配體通過相互作用來調(diào)節(jié)微小隱孢子蟲粘附和侵入宿主細(xì)胞膜，這是由數(shù)個復(fù)雜的過程構(gòu)成，它涉及了多種寄生蟲分子和宿主分子。為了掌握隱孢子蟲病隱性感染的機制并制定治療隱孢子蟲病的策略，我們必需知曉這些過程的分子機制。在頂復(fù)門其它寄生原蟲中，含TSP1樣結(jié)構(gòu)域的蛋白在蟲體粘附侵入宿主細(xì)胞中發(fā)揮重要的作用，經(jīng)過對微小隱孢子蟲基因組序列的篩選，含TSP1結(jié)構(gòu)域的基因共有12種，這些基因都含有信號肽序列及1個或多個TSP1樣結(jié)構(gòu)域，另外還包含其他參與細(xì)胞間相互作用的結(jié)構(gòu)域，如Kringle、表皮生長因子、Apple結(jié)構(gòu)域，特別是目前諸多的研究結(jié)果都暗示TSP家族中TRAP-C1蛋白與微小隱孢子蟲的粘附密切相關(guān)。雖然微小隱孢子蟲的TSP家族蛋白的功能還不確定，微小隱孢子蟲與頂復(fù)門其他寄生蟲TRAP家族蛋白序列的同源性和結(jié)構(gòu)的相似性暗示微小隱孢子蟲TSP家族蛋白可能也參與侵入宿主細(xì)胞的過程。 本實驗選擇CpTSP6、CpTSP7、CpTSP8、CpTSP10四種蛋白進(jìn)行研究。從基因庫中選取目的基因片段進(jìn)行原核表達(dá)，并通過Western blotting、親和ELISA、Cell blot3種方法檢測以上4種重組蛋白對上皮樣細(xì)胞是否具有粘附作用。 根據(jù)GenBank上CpTSP6、CpTSP7、CpTSP8、CpTSP10的基因序列設(shè)計引物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后得到CpTSP6、CpTSP7、CpTSP8、CpTSP10目的基因片段的大小分別為420bp、587bp、603bp和897bp。將目的片段連接在pMD18-T載體上，對構(gòu)建的克隆載體鑒定、測序正確后，將目的片段克隆在表達(dá)載體上，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。對構(gòu)建的四種表達(dá)載體鑒定、測序及比對。經(jīng)過表達(dá)溫度條件的比較和不同溫度下重組蛋白可溶性的比較后選擇最佳表達(dá)條件，經(jīng)0.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)菌體大量表達(dá)后超聲破菌，從而獲得可溶性表達(dá)產(chǎn)物，對目的蛋白質(zhì)用Gluthathione-Sepharose4B磁珠進(jìn)行純化，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定rGST-TSP6、rGST-TSP7、rGST-TSP8、rGST-TSP10，相對分子量分別為41KDa、47KDa、45KDa、58KDa，與預(yù)計的分子量大小相符。 以純化的rGST-TSP6、rGST-TSP7、rGST-TSP8、rGST-TSP10為抗原，采用抗原與弗氏佐劑混合乳化的方式免疫BALB/c小鼠，從而制備多克隆抗體。將4種蛋白分別與Caco-2細(xì)胞、HCT-8細(xì)胞、MDBK細(xì)胞共孵育后，通過Westernblotting檢測到rGST-TSP6和rGST-TSP8能結(jié)合上述3種細(xì)胞，而GST蛋白不結(jié)合。通過細(xì)胞親和ELISA的方法測定4種重組蛋白對3種細(xì)胞的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)rGST-TSP6和rGST-TSP8與3種細(xì)胞的結(jié)合與對照組GST蛋白相比差異顯著（P0.05），且在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性。通過非變性凝膠電泳將4種重組蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，再與3種懸浮細(xì)胞共孵育后，通過氨基黑染色發(fā)現(xiàn)rGST-TSP6和rGST-TSP8可以與3種細(xì)胞結(jié)合，同時，該結(jié)合可以被針對蛋白質(zhì)的多克隆抗體阻斷。表明該結(jié)合具有特異性。 因此，TSP家族中的CpTSP6和CpTSP8蛋白參與了微小隱孢子蟲與宿主細(xì)胞的黏附過程。
【關(guān)鍵詞】：微小隱孢子蟲 TSP1結(jié)構(gòu)域 黏附 Cell blot Western blotting、親和ELISA
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R382.3
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 前言12-14
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述14-28
• 第一章 微小隱孢子蟲粘附相關(guān)蛋白研究進(jìn)展14-28
• 1.1 隱孢子蟲簡介14-16
• 1.2 微小隱孢子蟲主要的粘附相關(guān)蛋白16-27
• 1.3 結(jié)語27-28
• 第二篇 研究內(nèi)容28-78
• 第一章 微小隱孢子蟲 TSP6、TSP7、TSP8、 TSP10 基因的克隆及表達(dá)28-56
• 1.1 材料28-31
• 1.2 方法31-42
• 1.3 結(jié)果42-52
• 1.4 討論52-55
• 1.5 小結(jié)55-56
• 第二章 HCT-8、Caco-2、MDBK 三種上皮細(xì)胞的培養(yǎng)56-60
• 2.1 材料56-57
• 2.2 方法57-58
• 2.3 結(jié)果58
• 2.4 討論58-59
• 2.5 小結(jié)59-60
• 第三章 rGST-TSP6、rGST-TSP7、rGST-TSP8、rGST-TSP10 對三種上皮細(xì)胞系粘附特性的研究60-78
• 3.1 材料60-62
• 3.2 方法62-66
• 3.3 結(jié)果66-74
• 3.4 討論74-76
• 3.5 小結(jié)76-78
• 結(jié)論78-79
• 參考文獻(xiàn)79-89
• 導(dǎo)師簡介89-90
• 作者簡介90
• 攻讀碩士學(xué)位期間取得的成果90-91
• 致謝91

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