發(fā)布時間：2017-05-29 13:13

  本文關鍵詞：結核分枝桿菌表面蛋白PPE19在壓力反應和毒力中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：結核病是一個全球范圍的健康難題,全世界有三分之一的人感染結核病,并且每年以上百萬的人數(shù)在增加。結核分枝桿菌是引起結核病的一類病原菌,它能侵犯人體的各個器官,但以肺部結核病最嚴重。盡管預防疫苗以及用于治療結核病的抗結核菌藥物不斷出現(xiàn),但是由于耐藥性菌株的不斷出現(xiàn),以及結核病與HIV共感染,結核病目前仍然是威脅人類健康的主要傳染病。 結核分枝桿菌在感染人體以及在巨噬細胞中成功的生存下來的過程中會面臨來自機體的多種壓力條件,其中包括由巨噬細胞產生的氧化壓力,吞噬體產生的酸性壓力,肺泡表面活性物質引起的表面結構的損傷,以及在肉芽腫以及吞噬體中的低氧環(huán)境和營養(yǎng)物質的缺乏。除此之外,分枝桿菌在傳播過程中還會遭受到紫外的照射,脫水,以及低溫等多種壓力。結核分枝桿菌能夠在這些環(huán)境中生存并適應下來,需要復雜的基因的調控。 結核分枝桿菌PPE家族基因因其在結核分枝桿菌與宿主間的相互作用中發(fā)揮重要的功能而越來越被重視。該家族基因主要參與結核分枝桿菌的毒力,作為抗原變異的來源,以及作為血清診療工具等發(fā)揮作用。通過文獻調研,我們發(fā)現(xiàn)PPE家族的一個基因—PPE19,是結核分枝桿菌壓力反應因子SigB的一個重要的調控子。SigB基因在細菌壓力反應中發(fā)揮了重要的作用,SigB缺失菌株對類似SDS誘導的表面壓力、氧化壓力、熱激以及萬古霉素等均表現(xiàn)得更加敏感。我們推測PPE19作為SigB因子的一個調控子,可能也會在應對這些或其中某種壓力環(huán)境中發(fā)揮一定的作用。 為了研究PPE19是否會在結核分枝桿菌應對環(huán)境壓力中發(fā)揮作用,我們首先以結核分枝桿菌H37Rv基因組為模板,對PPE19(Rv1361c)基因進行了克隆,并將其與帶有Myc標簽的穿梭質粒pNIT連接,獲得pNIT-RV1361c重組質粒,之后重組質粒轉入生長速度較快且無毒力的恥垢分枝桿菌mc2155菌株中,成功構建了表達PPE19重組蛋白的重組恥垢分枝桿菌。通過分級分離以及蛋白酶K消化分析,應用Western-blotting技術檢測了目的蛋白在重組恥垢分枝桿菌中的定位。為了研究外源PPE19蛋白的過表達是否會對恥垢分枝桿菌的生長產生影響,我們檢測了PPE19重組菌與只含有pNIT空載的恥垢分枝桿菌對照菌的生長曲線。為了解PPE19蛋白是否與結核分枝桿菌在多種壓力環(huán)境下的存活相關,我們檢測了PPE19重組菌以及空載菌在營養(yǎng)饑餓條件下,酸性條件,SDS引起的表面壓力,由聯(lián)氨誘導的氧化壓力,以及抗生素(異煙肼,諾氟沙星),酸性NO等體外壓力環(huán)境下的生長情況,同時檢測了PPE19的過表達菌株在巨噬細胞內的存活以及對巨噬細胞的影響。 我們的研究結果表明,PPE19(Rv1361c or mtb39b)只存在于結核分枝桿菌的牛分枝桿菌中。盡管PPE19定位在細胞表面,但是并沒有對恥垢分枝桿菌的表面特性如菌落形態(tài),生物膜的形成等產生明顯的影響。然而,PPE19的過表達增強了恥垢分枝桿菌在穩(wěn)定期的生長,增加了對饑餓條件,酸性壓力,表面壓力,氧化壓力以及異煙肼藥物等多種壓力環(huán)境的耐受。值得注意的是,盡管PPE19對多種壓力條件產生耐受性,然而對于諾氟沙星和酸性NaNO2的處理卻表現(xiàn)出一定的敏感性。盡管PPE19在應對體外多種壓力環(huán)境時表現(xiàn)出截然相反的結果,然而在具有多重壓力環(huán)境的RAW264.7巨噬細胞中,PPE19明顯增強恥垢分枝桿菌的存活,但是沒有明顯改變細胞內相關細胞因子的轉錄水平。 通過本研究,證實了結核分枝桿菌PPE19蛋白在應對壓力脅迫中發(fā)揮了重要作用,可能是通過改變細胞表面組分或參與維持遺傳物質穩(wěn)定性完成的。本研究將為PPE家族基因添加新功能,同時為進一步研究結核分枝桿菌免疫逃避的機制奠定了基礎。
【關鍵詞】：結核分枝桿菌 PPE家族 PPE19 壓力反應
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第1章 綜述10-16
• 1.1 引言10
• 1.2 分枝桿菌Ⅶ型分泌系統(tǒng)簡介10-11
• 1.3 結核分枝桿菌ESX-5分泌系統(tǒng)的組成11-13
• 1.3.1 ESX-5基因簇內的ESX核心組分11-12
• 1.3.2 ESX-5基因簇內部的PE/PPE基因12
• 1.3.3 ESX-5通道組分12-13
• 1.3.4 ESX-5基因簇內其他基因13
• 1.4 ESX-5的功能介紹13-14
• 1.4.1 ESX-5分泌系統(tǒng)分泌多種蛋白13
• 1.4.2 ESX-5分泌的效應分子激活巨噬細胞誘導炎性產生13-14
• 1.5 目前已知的通過ESX-5分泌系統(tǒng)進行分泌的蛋白及可能的機制14-15
• 1.5.1 目前已知的通過ESX-5分泌系統(tǒng)進行分泌的蛋白14
• 1.5.2 ESX-5分泌模式及機制14-15
• 1.6 總結和展望15-16
• 第2章 前言16-17
• 第3章 實驗材料和方法17-30
• 3.1 實驗材料17-19
• 3.1.1 實驗菌株、載體和細胞17
• 3.1.2 培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基17-18
• 3.1.3 實驗所需試劑18-19
• 3.1.4 試驗儀器19
• 3.2 實驗方法19-30
• 3.2.1 結核分枝桿菌PPE19(Rv1361c)基因的擴增19-20
• 3.2.2 Rvl361c PCR產物的回收20
• 3.2.3 制備大腸桿菌感受態(tài)細胞20
• 3.2.4 大腸桿菌的轉化(熱激法)20-21
• 3.2.5 PPE19(Rv1361c)基因的TA克隆21
• 3.2.6 重組質粒的提取21
• 3.2.7 PPE19(Rv1361c)重組質粒的構建21-22
• 3.2.8 PPE19(Rv1361c)重組蛋白在大腸桿菌中的表達和純化22-23
• 3.2.9 PPE19(Rv1361c)重組恥垢分枝桿菌的構建23-25
• 3.2.10 PPE19(Rv1361c)重組蛋白在恥垢分枝桿菌中的亞細胞定位分析25-26
• 3.2.11 過表達PPE19(Rv1361c)對恥垢分枝桿菌對SDS耐受的影響26
• 3.2.12 過表達PPE19(Rv1361c)蛋白對恥垢分枝桿菌饑餓、酸性以及氧化壓力的影響26
• 3.2.13 過表達PPE19(Rv1361c)重組蛋白對恥垢分枝桿菌抗生素耐受的影響26
• 3.2.14 過表達PPE19(Rv1361c)重組蛋白對恥垢分枝桿菌亞硝酸鈉耐受的影響26-27
• 3.2.15 Rv1361c對相關基因轉錄水平的影響27-28
• 3.2.16 M.s-pNIT-Rv1361c重組菌侵染RAW264.7巨噬細胞后存活率檢測28-30
• 第4章 結果與分析30-41
• 4.1 從基因組中擴增Rvl361c基因30
• 4.2 構建BL21-pET-28(+)-Rv1361c重組大腸桿菌30-31
• 4.3 PPE19(Rv1361c)重組蛋白在大腸桿菌BL21中的表達純化31-32
• 4.4 構建pNIT-Rv1361c重組恥垢分枝桿菌32
• 4.5 pNIT(Myc)-PPE19重組蛋白在恥垢分枝桿菌中成功表達32-33
• 4.6 PPE19定位在恥垢分枝桿菌細胞表面33-34
• 4.7 PPE19對重組恥垢分枝桿菌菌落形態(tài)和生物膜形成沒有明顯影響34-35
• 4.8 PPE19增強恥垢分枝桿菌在穩(wěn)定期的生長35
• 4.9 PPE19增強恥垢分枝桿菌在營養(yǎng)饑餓以及酸性條件下的存活35-36
• 4.10 PPE19增強恥垢分枝桿菌對SDS的耐受36-37
• 4.11 PPE19增強恥垢分枝桿菌對氧化劑聯(lián)氨的耐受37
• 4.12 PPE19增強恥垢分枝桿菌對異煙肼藥物的耐受37-38
• 4.13 PPE19增強恥垢分枝桿菌對諾氟沙星的敏感性38
• 4.14 PPE19增強恥垢分枝桿菌對RNS的敏感38-39
• 4.15 PPE19增強恥垢分枝桿菌在RAW264.7巨噬細胞中的存活39-40
• 4.16 PPE19對巨噬細胞內細胞因子沒有明顯改變40-41
• 第5章 結論與展望41-43
• 5.1 實驗結論41
• 5.2 討論分析41-42
• 5.3 展望42-43
• 參考文獻43-47
• 致謝47-49
• 在學期間所發(fā)表的文章49

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前1條

1 Oya Uygur-Bayrami噻li;Gül Dabak;Resat Dabak;;A clinical dilemma:abdominal tuberculosis[J];World Journal of Gastroenterology;2003年05期

  本文關鍵詞：結核分枝桿菌表面蛋白PPE19在壓力反應和毒力中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：404975