本文關(guān)鍵詞：梅毒螺旋體膜蛋白TprF抗原表位的預(yù)測(cè)與鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：篩選和鑒定梅毒螺旋體(Treponema pallidum, Tp)膜蛋白TprF的B細(xì)胞表位、Th細(xì)胞表位和聯(lián)合Th-B細(xì)胞表位，，為深入研究Tp菌影多價(jià)表位疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和基礎(chǔ)。 方法： (1) TprF抗原表位預(yù)測(cè)：從Genbank獲取TprF的序列，采用SignalP4.0、TMHMM2.0等軟件預(yù)測(cè)其信號(hào)肽和跨膜區(qū)；以IEDB、HLAPrep、SYFPEITHI等軟件綜合預(yù)測(cè)外膜蛋白TprF21-284aa的MHC-II類限制性Th細(xì)胞表位；運(yùn)用IEDB和Mobyle等在線軟件分析TprF，得到其編碼蛋白的物理和化學(xué)特性如親水性、可及性、易屈性及抗原性等，并由此評(píng)估TprF的B細(xì)胞表位；聯(lián)合B-Th細(xì)胞表位為上述方法預(yù)測(cè)表位的重疊區(qū)。 (2) TprF預(yù)測(cè)表位合成與鑒定：委托北京澤溪源生物科技股份有限公司人工合成，表位多肽經(jīng)反相高效液相色譜純化，由質(zhì)譜分析鑒定。 (3)重組TprF21-284aa表達(dá)與免疫反應(yīng)性鑒定：構(gòu)建pET30a(+)/TprF21-284aa的原核表達(dá)重組載體，轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coli BL21(DE3)后經(jīng)菌液PCR、測(cè)序和雙酶切鑒定；SDS-PAGE和蛋白免疫印跡法（WB）對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析和鑒定；親和層析法純化，BCA法測(cè)定蛋白濃度。 (4)重組TprF21-284aa免疫原性鑒定：新西蘭兔用重組TprF21-284aa免疫5次，分別收集每次免疫血清，測(cè)定重組蛋白抗體效價(jià)；末次免疫后10天，處死兔子，分離脾細(xì)胞用于Th細(xì)胞表位的鑒定。 (5) TprF的B細(xì)胞表位鑒定：分別將合成的B/B-Th表位多肽和重組TprF作為抗原包被在酶標(biāo)板上，以免疫兔血清和梅毒患者病人血清為一抗（同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照孔）以間接ELISA法鑒定TprF的B/B-Th表位。 (6) TprF的T細(xì)胞表位鑒定：陰性對(duì)照組為PBS，陽(yáng)性對(duì)照組為ConA和重組TprF21-284aa全蛋白，實(shí)驗(yàn)組為合成的T/Th-B表位多肽，分別刺激培養(yǎng)免疫兔脾細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)刺激其增殖水平，鑒定TprF中預(yù)測(cè)的Th細(xì)胞表位。 結(jié)果： (1)綜合分析在線軟件方案，預(yù)測(cè)TprF的候選B細(xì)胞表位為B1(43-62AA)、B2（89-103AA）、B3（231-251AA）；候選Th細(xì)胞表位為T(mén)1（81-88AA）、T2（132-146AA）、T3（183-198AA）；候選聯(lián)合Th-B表位為L(zhǎng)1（57-71AA）、L2（125-138AA）、L3（268-279AA）。 (2)合成多肽純度均大于90%；質(zhì)譜分析合成多肽分子量測(cè)定值與理論值一致。 (3)經(jīng)PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定，插入片段為目的基因；SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組蛋白約36kDa大小，目的蛋白在表達(dá)菌中能夠以可溶性蛋白形式表達(dá)；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，重組蛋白與anti-His抗體、梅毒陽(yáng)性病人血清、兔免疫血清產(chǎn)生特異性反應(yīng)；ELISA檢測(cè)TprF21-284aa抗體效價(jià)均在1:12000以上。 (4) ELISA結(jié)果顯示，預(yù)測(cè)表位B1、T1與兔免疫血清、梅毒患者血清均呈陽(yáng)性反應(yīng)，而與健康動(dòng)物（人和兔）、鉤體病人血清均不反應(yīng)。 (5) CCK-8法檢測(cè)結(jié)果表明，預(yù)測(cè)多肽刺激的兔脾細(xì)胞無(wú)明顯增殖。 結(jié)論： (1)原核表達(dá)載體pET30a-TprF21-284aa成功構(gòu)建并表達(dá)，該重組蛋白具有良好的免疫原性與抗原性； (2)預(yù)測(cè)的表位B1、T1可能為T(mén)prF蛋白B細(xì)胞表位； (3)預(yù)測(cè)的表位T1、T2、T3、L1、L2、L3可能不是兔MHC分子提呈的TprF蛋白Th細(xì)胞表位。
【關(guān)鍵詞】：梅毒螺旋體 TprF 膜蛋白 抗原表位 疫苗
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R377.1
【目錄】：

• 主要中英文縮寫(xiě)4-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-13
• 實(shí)驗(yàn)材料13-16
• 實(shí)驗(yàn)方法16-27
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-40
• 討論40-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 附錄48-52
• 綜述52-61
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 在讀期間科研成果61-62
• 致謝62

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本文編號(hào)：402198