發(fā)布時(shí)間：2017-05-27 16:09

  本文關(guān)鍵詞：羊口瘡病毒編碼的一種新型NF-κB核抑制劑002蛋白的分子機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：羊口瘡又稱羊傳染性膿皰病或羊傳染性膿皰性皮炎,是由羊口瘡病毒(ORFV)引起的山羊、綿羊和人的一種急性、接觸性傳染病。羊口瘡病毒通常侵襲患羊的唇部、鼻孔周圍和乳頭等破損處皮膚和粘膜,形成紅斑、丘疹、膿瘡、潰瘍和疣狀痂皮,主要引起皮膚和黏膜的增生性病變。該病的感染率高達(dá)80~89%,死亡率達(dá)5~6%,幼齡羔羊的死亡率可達(dá)93%。羊口瘡在世界各地均有發(fā)生,尤其是養(yǎng)羊較多的地區(qū),可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 ORFV為雙鏈DNA病毒,屬于痘病毒科,脊椎動(dòng)物痘病毒亞科,副痘病毒屬。這個(gè)屬的其他成員還包括小牛侵蝕性口炎病毒(bovine papular stomatitis virus, BPSV)和偽牛痘病毒(pseudocowpox virus, PCPV)等。電鏡下,ORFV為橢圓形,大小260~300nm×160~190nm,特征形態(tài)為橢圓顆粒外包繞相互交錯(cuò)的小管,呈線團(tuán)樣結(jié)構(gòu)。ORFV基因組全長(zhǎng)約140kbp,至少含有132個(gè)預(yù)測(cè)基因。 研究表明,羊口瘡病毒的許多編碼蛋白可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)過程。這些蛋白包括病毒IL-10同源蛋白(ORFV127)、趨化因子結(jié)合蛋白(ORFV112)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞克隆刺激因子和IL-2抑制蛋白(ORFV117)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(ORFV132)、干擾素抗性蛋白(ORFV020)、BCL-2樣蛋白(ORFV125)以及NF-κB信號(hào)通路抑制蛋白(ORFV024, ORFV002, ORFV121)[4]。 本研究小組的前期研究發(fā)現(xiàn)ORFV002是一種病毒晚期基因,蛋白合成后定位于細(xì)胞核內(nèi),在細(xì)胞核內(nèi)抑制NF-κB途徑。但是ORFV002發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不明確,仍然有待進(jìn)一步研究。因此本研究的目的在于闡明ORFV002抑制p300與p65相互作用的機(jī)制,明確ORFV002發(fā)揮生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)域以及尋找宿主內(nèi)與ORFV002相互作用的其他蛋白。 為了明確ORFV002可能的作用區(qū)域,構(gòu)建了四個(gè)缺失各個(gè)結(jié)構(gòu)域的重組載體,分別是ORFV002GFP M1(△結(jié)構(gòu)域1)、ORFV002M2(△結(jié)構(gòu)域1和2)、ORFV002M3(△結(jié)構(gòu)域3)、ORFV002M4(△結(jié)構(gòu)域2和3),用以鑒定002蛋白的功能性結(jié)構(gòu)域,將這些突變體構(gòu)建于含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的真核表達(dá)載體中,并都在正確位置獲得表達(dá)。 利用激光共聚焦顯微鏡觀察了ORFV002及其突變體的細(xì)胞內(nèi)的定位情況。結(jié)果表明,ORFV002定位于細(xì)胞核,而蛋白在細(xì)胞中的定位與其功能是息息相關(guān)的。融合表達(dá)了GFP標(biāo)簽的ORFV002定位在細(xì)胞核內(nèi);保留了N端序列的002突變體,GM3和GM4與野生型ORFV002定位一致,熒光信號(hào)也在細(xì)胞核內(nèi)；而缺失了N端序列的突變體002GM1, GM2的熒光信號(hào)則與對(duì)照GFP蛋白一樣,是定位在細(xì)胞質(zhì)中的。研究結(jié)果初步提示ORFV002蛋白的N端,尤其是CR1區(qū)對(duì)于該蛋白在細(xì)胞中的定位以及功能的發(fā)揮是非常重要的。 進(jìn)一步觀察ORFV002蛋白及其各突變體對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響,采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試驗(yàn)盒測(cè)定002及其各突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。野生型002,002GM3和002GM4能夠顯著降低NF-κB p65的轉(zhuǎn)錄活性,熒光素酶活性增強(qiáng)不明顯,而002GM1,002GM2和GFP則對(duì)NF-κB p65沒有抑制作用,NF-α和LPS刺激引起熒光素酶活性顯著增強(qiáng)。這一結(jié)果與共聚焦定位的結(jié)果一致,提示ORFV002的N端序列是決定該蛋白功能的主要區(qū)域。 ORFV002通過抑制NF-κB-p65第310位賴氨酸(Lys)的乙�；瘉�(lái)發(fā)揮作用。利用Western blot驗(yàn)證了002及其各突變體對(duì)NF-κB-p65乙�；挠绊�。表達(dá)野生型的002及包含002N端序列的突變體GM3,GM4蛋白的細(xì)胞中,NF-κB-P65第310位賴氨酸乙�；矫黠@減弱,表明這些蛋白的表達(dá)能夠抑制p65Lys310的乙�；�。相反,表達(dá)突變體002GM1(缺失了N端52個(gè)氨基酸)和002GM2(缺失N端94個(gè)氨基酸)和GFP的細(xì)胞中,p65Lys310的乙酰化仍處于較高水平。p65蛋白生成后,要經(jīng)過一系列嚴(yán)密的磷酸化、乙�；揎椪{(diào)控,才能保證下游基因的正確表達(dá)。其中Ser276這個(gè)磷酸化位點(diǎn)是p65中相當(dāng)保守的一個(gè)磷酸化位點(diǎn)。在細(xì)胞核中,Ser276磷酸化會(huì)導(dǎo)致p65匯集轉(zhuǎn)錄共激活因子p300/CBP, p300/CBP乙�；疞ys310,然后才能調(diào)控下游基因的表達(dá)。鑒于002能夠干擾p65和p300的結(jié)合,因此提出假設(shè)：ORFV002通過影響p65Ser276的磷酸化,從而阻斷了p65的轉(zhuǎn)錄活性。接下來(lái),我們通過Western blot實(shí)驗(yàn)對(duì)ORFV002能否抑制p65Ser276的磷酸化進(jìn)行了驗(yàn)證。Western blot結(jié)果表明ORFV002及其含有N端序列的突變載體在OFTu中的表達(dá)使得p65Ser276的磷酸化水平明顯下降。這正和我們的假設(shè)一致,即002抑制了p65Ser276的磷酸化。p65進(jìn)入細(xì)胞核后,在p38和MKK6的協(xié)助下,由MSK1來(lái)磷酸化p65Ser276這一位點(diǎn),磷酸化后的p65能匯集共刺激因子CBP/P300,從而使得下游轉(zhuǎn)錄被激活。ORFV002正是作用于這一位點(diǎn),使得MSK1磷酸化過程被抑制。 為了進(jìn)一步了解ORFV002在細(xì)胞內(nèi)的其它功能,利用酵母雙雜交技術(shù)來(lái)鑒定與ORFV002的互作的蛋白。將ORFV002構(gòu)建到載體pGBKT7中作誘餌,把羊胚胎鼻甲細(xì)胞cDNA構(gòu)建到載體pGADT7中作文庫(kù),通過篩選cDNA文庫(kù),一共獲得了25個(gè)在酵母內(nèi)與002相互作用的陽(yáng)性克隆。對(duì)其測(cè)序結(jié)果利用BLASTn對(duì)其驗(yàn)證和比對(duì),結(jié)果證實(shí)25個(gè)陽(yáng)性克隆分別編碼3種不同的蛋白,其中22個(gè)為鈣結(jié)合蛋白S100A4。以免疫熒光、GST pull down和免疫共沉淀技術(shù)對(duì)S100A4與ORFV002的相互作用做進(jìn)一步驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明S100A4與ORFV002在體內(nèi)和體外均存在相互作用。 通過以上研究,對(duì)ORFV002抑制NF-κB的分子作用機(jī)制進(jìn)行了鑒定。ORFV002通過其N端功能結(jié)構(gòu)域抑制MSK1介導(dǎo)的NF-κB p65Ser276的磷酸化,從而抑制了NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,研究還發(fā)現(xiàn)ORFV002和S100A4存在相互作用。研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步確定NF-κB信號(hào)途徑對(duì)病毒感染的反應(yīng),以及識(shí)別該途徑中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),有助于開發(fā)針對(duì)該位點(diǎn)的潛在治療藥物。
【關(guān)鍵詞】：羊口瘡病毒 羊口瘡病毒002蛋白 核因子κB信號(hào)通路 酵母雙雜交
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R373;R3416
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 前言13-18
• 第一部分 ORFV002 N端抑制NF-κB p65 Ser~(276)磷酸化18-41
• 1 材料18-20
• 2 方法20-28
• 3 結(jié)果28-40
• 4 小結(jié)40-41
• 第二部分 發(fā)現(xiàn)與鑒定ORFV002與S100A4相互作用41-58
• 1 材料41-44
• 2 方法44-51
• 3 結(jié)果51-57
• 4 小結(jié)57-58
• 討論58-62
• 參考文獻(xiàn)62-67
• 致謝67-68

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 Yong-Gu Cho;Chang-Jae Kim;Suk-Woo Nam;Shin-Hee Yoon;Sug-Hyung Lee;Nam-Jin Yoo;Jung-Young Lee;Won-Sang Park;;Overexpression of S100A4 is closely associated with progression of colorectal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2005年31期

  本文關(guān)鍵詞：羊口瘡病毒編碼的一種新型NF-κB核抑制劑002蛋白的分子機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：400480