本文關(guān)鍵詞：抗人D-二聚體單克隆抗體的制備及應(yīng)用初探，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：從人交聯(lián)纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)中純化D-二聚體(D-dimer),并以人D-二聚體為抗原制該蛋白質(zhì)的單克隆抗體(McAb),在對(duì)其相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上,初步探索抗D-二聚體單克隆抗體(D-dimer McAb)的應(yīng)用。方法：1.利用人纖維蛋白原、凝血酶、凝血因子X(jué)Ⅲ、纖溶酶制備人交聯(lián)纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP);2.采用Sephacryl S-300層析過(guò)濾和PBE94聚焦層析兩步法從FDP中分離純化D-dimer;3.用純化的D-dimer免疫BALB/c小鼠,采用雜交瘤技術(shù)建立可分泌D-dimer McAb的雜交瘤細(xì)胞株,并對(duì)其進(jìn)行核染色體分析,同時(shí)使用間接EL ISA法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞株持續(xù)穩(wěn)定分泌抗體的能力。選取8株細(xì)胞株,采用體內(nèi)誘生腹水法制備腹水,并用半飽和硫酸銨沉淀法和DEAE affi-gel blue層析法分離純化腹水中的D-dimer McAb;4.采用SDS-PAGE電泳鑒定抗體的純度；瓊脂糖免疫雙向擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)鑒定D-dimer McAb的亞類；ELISA相加實(shí)驗(yàn)確定D-dimer McAb識(shí)別的抗原表位；間接ELISA法檢測(cè)D-dimer McAb的特異性,包括檢測(cè)其是否與D-片段、E-片段、纖維蛋白原、凝血酶和FXⅢ有交叉反應(yīng)和與D-dimer標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)情況；間接ELISA檢測(cè)D-dimer McAb的相對(duì)親和力及五種二價(jià)金屬離子對(duì)抗原抗體結(jié)合的影響。5.分別將03、05、07號(hào)D-dimer McAb與表面包被羧基基團(tuán)的聚苯乙烯乳膠微粒進(jìn)行偶聯(lián),檢測(cè)其偶聯(lián)效果。并將偶聯(lián)好的微粒與D-dimer混合,進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng),檢測(cè)其反應(yīng)效果。結(jié)果：1.經(jīng)兩步層析純化,D-dimer的回收率為(27.27±6.35)%,D-dimer/總蛋白含量比為(77.82±7.98)%(n=3)。2.成功建立了8株能分泌D-dimer McAb的雜交瘤細(xì)胞株,分別編號(hào)為01～08,其核染色體平均數(shù)為86-93。建立的8株雜交瘤細(xì)胞株已連續(xù)5個(gè)月穩(wěn)定分泌抗體。3.8株D-dimer McAb的性質(zhì)鑒定結(jié)果如下：所有抗體的亞型都是IgG2b;除02、08號(hào)D-dimer McAb外,01、03、04、05、06、07號(hào)D-dimer McAb與D-dimer標(biāo)準(zhǔn)品都有較高的反應(yīng)性；8株D-dimer McAb與D-片段、E-片段,纖維蛋白原、凝血酶和FXⅢ無(wú)交叉反應(yīng)；8株D-dimer McAb分別識(shí)別同一抗原表位或者識(shí)別的抗原表位在空間上較為接近；8株D-dimer McAb與抗原的相對(duì)親和力順序?yàn)?307≥0504≥01≥02≥0608；Zn2+能有效抑制01～08號(hào)D-dimer McAb與抗原的結(jié)合,Mn2+對(duì)06、07號(hào)D-dimer McAb與抗原的結(jié)合有抑制作用,但抑制效果較Zn2+弱。4. D-dimer McAb偶聯(lián)聚苯乙烯乳膠微粒的效果較好,但各株細(xì)胞的固定化率和特異性不一,03號(hào)抗體的偶聯(lián)率為52.16%、05號(hào)為29.80%、07號(hào)為77.41%。偶聯(lián)上抗體的聚苯乙烯乳膠微粒與D-dimer結(jié)合后,離心上清液在280nm處的吸光度平均下降59.54%。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的兩步層析法能有效地分離純化D-dimer,且純化的D-dimer能誘使BALB/c小鼠產(chǎn)生較高的免疫反應(yīng)；成功建立了8株能分泌D-dimer McAb的雜交瘤細(xì)胞株；利用D-dimer McAb偶聯(lián)聚苯乙烯乳膠微粒,偶聯(lián)的微�？梢院虳-dimer結(jié)合,為后續(xù)D-dimer檢測(cè)試劑盒的開發(fā)打下了物質(zhì)和技術(shù)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：D-二聚體 單克隆抗體 制備 應(yīng)用
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392

  本文關(guān)鍵詞：抗人D-二聚體單克隆抗體的制備及應(yīng)用初探，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：400285