本文關(guān)鍵詞：重組SALL4B蛋白的表達(dá)及功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)大規(guī)模表達(dá)并純化轉(zhuǎn)錄因子SALL4B蛋白,并對(duì)純化后的SALL4B蛋白的生物活性進(jìn)行驗(yàn)證。 方法及結(jié)果：SALL4是具有鋅指結(jié)構(gòu)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子。SALL4在干細(xì)胞多能性的維持及自我更新方面具有關(guān)鍵作用,并能夠有效的促進(jìn)造血干細(xì)胞擴(kuò)增,該蛋白在體內(nèi)主要有SALL4A及SALL4B兩種亞型。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建連接有穿膜肽TAT、6個(gè)組氨酸及人SALL4B基因的重組桿狀病毒,并使用該重組病毒感染高密度的Sf9(Spodoptera frugiperda,草地貪夜蛾)昆蟲細(xì)胞。通過SDS-PAGE及Western blot驗(yàn)證,目的蛋白TAT-SALL4B可溶性表達(dá)于Sf9昆蟲細(xì)胞內(nèi)。由于重組蛋白具有6xHis標(biāo)簽,故后續(xù)利用Ni離子在非變性條件下進(jìn)行親和層析純化獲得純度較高的目的蛋白。為初步測(cè)試純化后TAT-SALL4B的生物活性,100nM及500nM的TAT-SALL4B蛋白被直接添加入鋪有HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)液中,孵育1.5小時(shí)或8小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色以驗(yàn)證該蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞的能力。熒光顯微鏡顯示,重組TAT-SALL4B能夠進(jìn)入細(xì)胞并定位于細(xì)胞核,其信號(hào)強(qiáng)度與添加的目的蛋白濃度和孵育時(shí)間正向相關(guān)。為了進(jìn)一步測(cè)試TAT-SALL4B蛋白的轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因分析,結(jié)果表明加入10nM以上濃度的TAT-SALL4B蛋白即能夠有效激活OCT4啟動(dòng)子并啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)建立了利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)TAT-SALL4B蛋白的體系,并通過在非變性條件下進(jìn)行鎳離子親和層析而達(dá)到高效純化的目的。后續(xù)功能驗(yàn)證的結(jié)果顯示TAT-SALL4B夠在TAT的介導(dǎo)下有效穿膜,并定位于細(xì)胞核。同時(shí),純化后的TAT-SALL4B蛋白能夠激活OCT4啟動(dòng)子,具有轉(zhuǎn)錄活性。本實(shí)驗(yàn)為今后利用SALL4B蛋白在體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞并運(yùn)用于干細(xì)胞移植手術(shù)提供了一個(gè)有效的平臺(tái)。
【關(guān)鍵詞】：桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) 蛋白純化 報(bào)告基因 TAT-SALL4B 轉(zhuǎn)錄活性
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-6
• 前言6-9
• 實(shí)驗(yàn)材料及方法9-16
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料9-11
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法11-16
• 結(jié)果與分析16-26
• 3.1 重組TAT-SALLAB蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定16-20
• 3.2 重組TAT-SALLAB蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化條件的優(yōu)化20-22
• 3.3 重組TAT-SALLAB蛋白的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)22-24
• 3.4 重組TAT-SALL4B蛋白雙熒光素酶報(bào)告基因分析24-26
• 討論26-28
• 參考文獻(xiàn)28-31
• 論文綜述31-46
• 參考文獻(xiàn)40-46
• 附錄46-59
• 致謝59-61
• 研究生簡(jiǎn)歷61-62

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 喬永萍;任磊;王林;王祖勇;張其清;;穿膜肽Tat以脂筏介導(dǎo)的巨胞飲方式進(jìn)入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[J];廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2008年02期

  本文關(guān)鍵詞：重組SALL4B蛋白的表達(dá)及功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：399998