本文關鍵詞：重組SALL4B蛋白的表達及功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)大規(guī)模表達并純化轉(zhuǎn)錄因子SALL4B蛋白,并對純化后的SALL4B蛋白的生物活性進行驗證。 方法及結果：SALL4是具有鋅指結構的細胞轉(zhuǎn)錄因子。SALL4在干細胞多能性的維持及自我更新方面具有關鍵作用,并能夠有效的促進造血干細胞擴增,該蛋白在體內(nèi)主要有SALL4A及SALL4B兩種亞型。本實驗通過構建連接有穿膜肽TAT、6個組氨酸及人SALL4B基因的重組桿狀病毒,并使用該重組病毒感染高密度的Sf9(Spodoptera frugiperda,草地貪夜蛾)昆蟲細胞。通過SDS-PAGE及Western blot驗證,目的蛋白TAT-SALL4B可溶性表達于Sf9昆蟲細胞內(nèi)。由于重組蛋白具有6xHis標簽,故后續(xù)利用Ni離子在非變性條件下進行親和層析純化獲得純度較高的目的蛋白。為初步測試純化后TAT-SALL4B的生物活性,100nM及500nM的TAT-SALL4B蛋白被直接添加入鋪有HeLa細胞的培養(yǎng)液中,孵育1.5小時或8小時后進行細胞免疫熒光染色以驗證該蛋白轉(zhuǎn)導進入細胞的能力。熒光顯微鏡顯示,重組TAT-SALL4B能夠進入細胞并定位于細胞核,其信號強度與添加的目的蛋白濃度和孵育時間正向相關。為了進一步測試TAT-SALL4B蛋白的轉(zhuǎn)錄活性,進行了雙熒光素酶報告基因分析,結果表明加入10nM以上濃度的TAT-SALL4B蛋白即能夠有效激活OCT4啟動子并啟動下游基因的表達。 結論：本實驗建立了利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)高效表達TAT-SALL4B蛋白的體系,并通過在非變性條件下進行鎳離子親和層析而達到高效純化的目的。后續(xù)功能驗證的結果顯示TAT-SALL4B夠在TAT的介導下有效穿膜,并定位于細胞核。同時,純化后的TAT-SALL4B蛋白能夠激活OCT4啟動子,具有轉(zhuǎn)錄活性。本實驗為今后利用SALL4B蛋白在體外擴增造血干細胞并運用于干細胞移植手術提供了一個有效的平臺。
【關鍵詞】：桿狀病毒表達系統(tǒng) 蛋白純化 報告基因 TAT-SALL4B 轉(zhuǎn)錄活性
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R3411
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-6
• 前言6-9
• 實驗材料及方法9-16
• 1. 實驗材料9-11
• 2. 實驗方法11-16
• 結果與分析16-26
• 3.1 重組TAT-SALLAB蛋白誘導表達及鑒定16-20
• 3.2 重組TAT-SALLAB蛋白誘導表達及純化條件的優(yōu)化20-22
• 3.3 重組TAT-SALLAB蛋白的細胞轉(zhuǎn)導實驗22-24
• 3.4 重組TAT-SALL4B蛋白雙熒光素酶報告基因分析24-26
• 討論26-28
• 參考文獻28-31
• 論文綜述31-46
• 參考文獻40-46
• 附錄46-59
• 致謝59-61
• 研究生簡歷61-62

【參考文獻】

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1 喬永萍;任磊;王林;王祖勇;張其清;;穿膜肽Tat以脂筏介導的巨胞飲方式進入骨髓間充質(zhì)干細胞[J];廈門大學學報(自然科學版);2008年02期

  本文關鍵詞：重組SALL4B蛋白的表達及功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：399998