研究輪狀病毒(Rotavirus,RV)非結(jié)構(gòu)蛋白5(NSP5)在體外對(duì)RV復(fù)制的作用。以質(zhì)粒pEGFP-N2為載體構(gòu)建出可特異性表達(dá)重組蛋白NSP5的真核表達(dá)載體后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MA104細(xì)胞并分別通過(guò)免疫熒光和Western Blot檢測(cè)NSP5在轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間的表達(dá)差異。隨后,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組細(xì)胞分別接種相同劑量的RV,一定時(shí)間后根據(jù)GFP分布來(lái)確認(rèn)重組蛋白NSP5在細(xì)胞內(nèi)的遷移變化情況,并比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的RV復(fù)制能力差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn),NSP5蛋白在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后表達(dá)達(dá)到頂峰。此外,GFP也顯示NSP5蛋白隨RV的感染從彌散狀轉(zhuǎn)變?yōu)辄c(diǎn)狀聚集,且轉(zhuǎn)染該重組質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)RV復(fù)制水平明顯高于對(duì)照細(xì)胞。說(shuō)明了輪狀病毒NSP5對(duì)病毒的復(fù)制具有明顯促進(jìn)作用,這也為深入了解RV的感染、復(fù)制及致病機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

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圖1pEGFP-N2-NSP5重組質(zhì)粒構(gòu)建流程

挑取培養(yǎng)板中長(zhǎng)勢(shì)良好的單克隆菌落至中管(Kana:50μg/mL)擴(kuò)大培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒,并對(duì)其進(jìn)行雙酶切、PCR及測(cè)序鑒定。特異表達(dá)重組蛋白NSP5的重組質(zhì)粒命名為pEGFP-N2-NSP5,構(gòu)建過(guò)程如圖1。1.2.4pEGFP-N2-NSP5的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染及其表達(dá)水平檢測(cè)

圖2重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定的電泳結(jié)果

重組質(zhì)粒pEGFP-N2-NSP5轉(zhuǎn)染MA104細(xì)胞后,分別于轉(zhuǎn)染24、36、48和72h后取出細(xì)胞做免疫熒光,并于倒置熒光顯微鏡下觀察特異性標(biāo)記紅色熒光的重組蛋白NSP5在細(xì)胞內(nèi)的分布及表達(dá)量與時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果顯示,重組蛋白NSP5在MA104細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中均有分布且主要....

圖3免疫熒光和WesternBlot鑒定pEGFP-N2-NSP5的NSP5蛋白表達(dá)

圖2重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定的電泳結(jié)果2.3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-NSP5對(duì)RV復(fù)制的影響

圖4pEGFP-N2-NSP5對(duì)RV復(fù)制影響的檢測(cè)結(jié)果

以RV標(biāo)準(zhǔn)毒株One-StepProbeqRT-PCR的Cq值為Y軸、標(biāo)準(zhǔn)毒株濃度以10為底的對(duì)數(shù)為X軸建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4-a):Y=-4.8205x+49.434,R2=0.9922。將RV樣品Cq值帶入標(biāo)曲后可求出對(duì)應(yīng)的RV拷貝濃度。3組不同處理的MA104細(xì)胞接種等量R....

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