本文關(guān)鍵詞：腸道病毒71型串聯(lián)表位疫苗的分子設(shè)計(jì)與免疫效果評(píng)價(jià)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腸道病毒71型（Enterovirus71,EV71）是小RNA病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬的重要成員，主要感染5歲以下兒童，是導(dǎo)致手足口病（Hand-Foot-Mouse）的主要病原體，廣泛流行于亞洲太平洋地區(qū)。該病毒可引起類(lèi)似于脊髓灰質(zhì)炎的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，是一種重要的新發(fā)嗜神經(jīng)病毒。目前臨床上并無(wú)針對(duì)EV71病毒的有效疫苗和特效藥物，疫苗是控制EV71感染的有效手段，許多疫苗候選株包括甲醛滅活病毒疫苗、減毒活疫苗、病毒樣顆粒疫苗、DNA疫苗以及亞單位疫苗都已取得了很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是缺乏有效的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)。 EV71病毒為單股正鏈RNA病毒，長(zhǎng)度約7500bp，包含單一開(kāi)放閱讀框（ORF），ORF首先編碼一個(gè)多聚蛋白,然后多聚蛋白被切割成VP1、VP2、VP3和VP4四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和若干個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。在病毒的結(jié)構(gòu)蛋白中，VP1、VP2和VP3暴露于病毒顆粒表面，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，決定了病毒的免疫原性，而VP4則完全位于病毒粒子的內(nèi)部，與病毒的復(fù)制翻譯有關(guān)。目前，許多EV71的線性中和表位已經(jīng)確定，我們利用軟件分析和序列比對(duì)篩選出在EV71不同基因亞型之間具有高度保守性的三個(gè)表位，它們分別是VP1蛋白上的SP55(氨基酸位置163-177)和SP70（氨基酸位置208-222）以及VP2蛋白上的SP28（氨基酸位置136-150），實(shí)驗(yàn)證明它們均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)EV71病毒的特異性中和抗體，是多表位疫苗的理想靶標(biāo)。 在本研究中，我們首先構(gòu)建了EV71多個(gè)串聯(lián)線性中和表位（SP55-SP70-SP28）的原核表達(dá)載體，隨后對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了EV71多表位串聯(lián)重組蛋白mTLNE。將純化后的mTLNE免疫小鼠，從體液和細(xì)胞免疫兩個(gè)方面，，系統(tǒng)評(píng)價(jià)mTLNE的免疫效果，并進(jìn)一步觀察免疫血清對(duì)小鼠的體內(nèi)保護(hù)效果，明確了mTLNE作為疫苗的可行性。 1. EV71串聯(lián)線性中和表位mTLNE的設(shè)計(jì)與構(gòu)建；我們首先對(duì)EV71B細(xì)胞表位的保守性進(jìn)行分析，選擇SP55、SP70和SP28三個(gè)線性中和表位為靶標(biāo)，再基于EV71國(guó)內(nèi)流行株AH08/06（GenBank：HQ611148）上三個(gè)線性中和表位的的基因序列以及pET32a上的限制性酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，為使三個(gè)表位能夠獨(dú)立的展示各自的抗原表位，在各表位之間插入蛋白Linker序列-（G4S）3。 為同時(shí)表達(dá)上述三個(gè)表位，我們利用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增三個(gè)串聯(lián)表位的基因序列，然后將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆到pET32a載體中，構(gòu)建包含mTLNE基因的重組質(zhì)粒，最后對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行核酸序列測(cè)定。結(jié)果表明成功構(gòu)建了包含mTLNE基因的原核表達(dá)載體。 2．重組蛋白的表達(dá)、純化和鑒定； 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，采用SDS-PAGE的方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在30KD附近出現(xiàn)了一條帶，與預(yù)期大小一致，說(shuō)明重組質(zhì)�？稍谠思�(xì)胞中表達(dá)目的蛋白。隨后又對(duì)誘導(dǎo)菌進(jìn)行超聲破碎處理，同樣采用SDS-PAGE鑒定，結(jié)果顯示：預(yù)期大小的條帶主要出現(xiàn)在誘導(dǎo)菌的上清中，證明mTLNE為可溶性蛋白。 隨后對(duì)mTLNE蛋白進(jìn)行大量表達(dá)，用可溶性蛋白試劑盒純化回收，并用SDS-PAGE、Western Blotting、ELISA等方法鑒定純化的蛋白，結(jié)果表明：獲得了mTLNE蛋白，其純度大于99%，并且mTLNE蛋白可與EV71病毒免疫的鼠血清和兔血清反應(yīng)，說(shuō)明重組蛋白mTLNE具有良好的抗原性。 3：重組蛋白mTLNE的免疫原性與免疫保護(hù)性分析； 將mTLNE蛋白免疫6周齡的BABL/c雌鼠(Trx蛋白為陰性對(duì)照)，每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，共免疫三次。采用ELISA的方法測(cè)定免疫血清的IgG效價(jià)及亞型，結(jié)果顯示：mTLNE初次免疫后即能夠誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生EV71病毒特異性的IgG抗體，且隨著免疫的加強(qiáng)，IgG效價(jià)逐漸升高，第二次加強(qiáng)免疫之后，IgG效價(jià)可以達(dá)到1:3191，lgG分型顯示mTLNE誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的lgG亞型主要為IgG1。采用TCID50的方法進(jìn)行中和滴度的測(cè)定，結(jié)果顯示第二次加強(qiáng)免疫后，免疫血清的中和抗體效價(jià)可以達(dá)到1:50。采用ELISPOT的方法對(duì)脾細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示mTLNE免疫小鼠后誘導(dǎo)其體內(nèi)產(chǎn)生的細(xì)胞因子以IL-4和IL-6為主。 隨后又測(cè)定了免疫血清對(duì)1日齡BALB/c乳鼠的體內(nèi)保護(hù)效果。結(jié)果顯示：注射mTLNE免疫血清的小鼠全部存活且沒(méi)有發(fā)病癥狀，而注射Trx免疫血清和PBS的小鼠在第5天開(kāi)始發(fā)病，10天之內(nèi)全部死亡，說(shuō)明mTLNE的免疫血清可以有效的保護(hù)新生乳鼠免受EV71病毒的攻擊。 本研究表明，在原核細(xì)胞中表達(dá)的EV71串聯(lián)多表位疫苗mTLNE，可有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，而且免疫血清能夠被動(dòng)保護(hù)乳鼠免受致死劑量的EV71攻擊。表明該疫苗可作為一種潛在的EV71疫苗候選株，以上結(jié)果為研制EV71新型疫苗提供了新思路。
【關(guān)鍵詞】：EV71疫苗 線性中和表位 保護(hù)
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【目錄】：

• 英文縮略詞表7-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-15
• 前言15-20
• 第一部分 EV71 串聯(lián)線性中和表位 mTLNE 的設(shè)計(jì)與構(gòu)建20-29
• 1. 引言20-21
• 2. 材料和方法21-24
• 2.1 材料21
• 2.2 方法21-24
• 3. 結(jié)果24-27
• 3.1 mTLNE 原核表達(dá)載體的構(gòu)建策略24-25
• 3.2 串聯(lián)多表位基因的重疊 PCR 擴(kuò)增25-26
• 3.3 PCR 產(chǎn)物和原核表達(dá)載體雙酶切與連接26-27
• 3.4 重組質(zhì)粒的鑒定27
• 4. 討論27-29
• 第二部分 重組蛋白 mTLNE 的表達(dá)、純化和鑒定29-40
• 1. 引言29
• 2. 材料和方法29-34
• 2.1 材料29-30
• 2.2 方法30-34
• 3. 結(jié)果34-39
• 3.1 mTLNE 和 Trx 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定34-36
• 3.2 mTLNE 和 Trx 蛋白的純化及鑒定36-39
• 4. 討論39-40
• 第三部分 重組蛋白 mTLNE 的免疫原性與免疫保護(hù)性分析40-51
• 1. 引言40
• 2. 材料和方法40-45
• 2.1 材料40-41
• 2.2 方法41-45
• 3. 結(jié)果45-49
• 3.1 免疫血清的免疫反應(yīng)性鑒定45-46
• 3.2 免疫血清 lgG 效價(jià)的測(cè)定46-47
• 3.3 免疫血清 lgG 亞型分析47
• 3.4 免疫小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子的測(cè)定47-48
• 3.5 免疫血清中和效價(jià)的測(cè)定48
• 3.6 免疫血清體內(nèi)保護(hù)效果的測(cè)定48-49
• 4. 討論49-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-58
• 附錄58-60
• 在讀期間撰寫(xiě)的論文60-61
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷61-62
• 致謝62-63
• 綜述及參考文獻(xiàn)63-72
• 參考文獻(xiàn)68-72

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

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本文編號(hào)：397283