本文關(guān)鍵詞：用大腸桿菌制備O157多糖—菌毛蛋白結(jié)合物的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在細(xì)菌疫苗研制領(lǐng)域,多糖疫苗一直以來(lái)占據(jù)了重要位置。然而,多糖作為T細(xì)胞非依賴型抗原,免疫原性較弱,對(duì)于小于2周歲的嬰幼兒及有免疫性缺陷病的高危人群不能產(chǎn)生有效的免疫力。目前多糖疫苗的研究重點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)向多糖-蛋白結(jié)合疫苗,多糖-蛋白結(jié)合疫苗能同時(shí)誘發(fā)機(jī)體非T細(xì)胞依賴和T細(xì)胞依賴的免疫反應(yīng),產(chǎn)生長(zhǎng)久的免疫保護(hù)作用。然而,細(xì)菌多糖-蛋白結(jié)合疫苗是通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)方法制備,存在產(chǎn)物不均一和成本高等缺陷。 近年來(lái),隨著生物信息學(xué)以及相關(guān)檢測(cè)方法的發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)糖基化修飾系統(tǒng)也廣泛存在于原核生物,其中,研究較為透徹的是空腸彎曲弧菌(Campylobacter jejuni)的N-糖基化修飾系統(tǒng)、腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)和綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)的O-糖基化修飾系統(tǒng),目前這三套糖基化修飾系統(tǒng)已經(jīng)功能性地轉(zhuǎn)移至大腸桿菌,并且,糖基化修飾途徑中的關(guān)鍵酶“寡糖轉(zhuǎn)移酶”對(duì)糖底物特異性要求較低,可以利用不同來(lái)源的多糖修飾目的蛋白。利用此優(yōu)點(diǎn),將具有免疫原性的多糖抗原轉(zhuǎn)移至合適的受體蛋白上,通過(guò)一步生物交聯(lián)法直接產(chǎn)生與天然多糖具有相同免疫原性的多糖-蛋白結(jié)合疫苗,克服了利用化學(xué)方法制備多糖-蛋白結(jié)合疫苗費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不均一等缺點(diǎn)。 目前,有關(guān)一步生物交聯(lián)法制備多糖-蛋白結(jié)合疫苗的研究多集中于空腸彎曲弧菌的N-糖基化修飾系統(tǒng)。空腸彎曲弧菌的N-糖基化修飾系統(tǒng)的寡糖轉(zhuǎn)移酶Pg1B要求糖底物的還原末端的第一個(gè)己糖的C-2位上有乙酰氨基,且第二個(gè)糖殘基與第一個(gè)糖殘基不以β(1-4)糖苷鍵連接,其糖基化作用位點(diǎn)的氨基酸保守序列為Asp/Glu-Y-Asn-X-Ser/Thr。而腦膜炎奈瑟球菌的O-糖基化修飾系統(tǒng)的寡糖轉(zhuǎn)移酶Pg1L與綠膿桿菌的O-糖基化修飾系統(tǒng)的寡糖轉(zhuǎn)移酶PilO對(duì)糖底物的要求低于Pg1B,C-2位無(wú)乙酰氨基的糖基均是其底物,然而,PilO只能將較短的寡糖或一個(gè)O-多糖重復(fù)單位作為糖底物,因此,利用PilO制備多糖-蛋白結(jié)合物具有一定的局限性,Pg1L具有更加廣闊的應(yīng)用前景。PglL與PilO對(duì)蛋白底物特異性的研究較少,目前腦膜炎奈瑟球菌MC58的菌毛蛋白PilE和綠膿桿菌1244的菌毛蛋白PilA分別是PglL和PilO的唯一蛋白底物。 本研究以腦膜炎奈瑟球菌的O-糖基化修飾系統(tǒng)為研究模型,通過(guò)在大腸桿菌中重構(gòu)腦膜炎奈瑟球菌的O-糖基化修飾系統(tǒng),考察寡糖轉(zhuǎn)移酶PglL能否利用異源的大腸桿菌O157型O多糖修飾目的蛋白PilE,從而為建立一步生物交聯(lián)法制備多糖蛋白結(jié)合疫苗技術(shù)提供基礎(chǔ)。本研究選取O多糖合成天然缺陷的大腸桿菌K12系列菌株W3110,通過(guò)Red重組技術(shù)敲除W3110的O抗原連接酶基因waaL,以阻斷其利用O多糖合成LPS的途徑,從而解決LPS合成途徑與糖基化修飾途徑競(jìng)爭(zhēng)“異源多糖”的問(wèn)題,構(gòu)建宿主菌CLM24。然后,通過(guò)在CLM24中共表達(dá)腦膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白基因pilE和寡糖轉(zhuǎn)移酶基因pglL,在CLM24中重構(gòu)腦膜炎奈瑟球菌的O-糖基化修飾系統(tǒng)。為了檢驗(yàn)該O-糖基化修飾系統(tǒng)是否正常發(fā)揮糖基化修飾菌毛蛋白PilE的功能,本研究首先通過(guò)共表達(dá)大腸桿菌鼠李糖轉(zhuǎn)移酶基因wbbL,修復(fù)CLM24的016型O多糖合成能力,研究Pg1L能否利用CLM24的016型O多糖修飾PilE。用抗PilE上His-tag的單抗進(jìn)行western印跡檢測(cè),顯示在16℃IPTG誘導(dǎo)條件下,單表達(dá)PilE-His的重組菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his在相對(duì)分子質(zhì)量19×103處有特異條帶,而同時(shí)表達(dá)PilE-His、PglL和WbbL的重組菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-wbbL-pglL不僅在相對(duì)分子質(zhì)量19×103處有特異條帶,而且在相對(duì)分子質(zhì)量(40-60)×103處也出現(xiàn)了特異的梯狀條帶,這表明,本研究在大腸桿菌CLM24中構(gòu)建的腦膜炎奈瑟球菌O糖基化修飾系統(tǒng)能夠發(fā)揮糖基化修飾菌毛蛋白PilE。在此基礎(chǔ)上,本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增大腸桿菌O157：H7的O多糖合成基因簇,構(gòu)建克隆載體pACYC184-O157,共轉(zhuǎn)化構(gòu)建了O-糖基化修飾系統(tǒng)的宿主菌,用抗PilE上His-tag的單抗和抗O157多抗分別進(jìn)行western印跡檢測(cè),結(jié)果表明,在建立了O-糖基化修飾系統(tǒng)的大腸桿菌中轉(zhuǎn)入大腸桿菌0157的O多糖基因簇克隆載體的重組菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-pglL/pACYC184-O157在相對(duì)分子質(zhì)量(40-60)×103處同樣產(chǎn)生特異的梯狀條帶。以上結(jié)果顯示,本研究在大腸桿菌中重建的O-糖基化修飾系統(tǒng)可以利用自身的O16型O多糖或異源的O157型O多糖修飾菌毛蛋白PilE,獲得了多糖-蛋白結(jié)合物,從而為一步生物交聯(lián)法制備多糖-蛋白結(jié)合疫苗提供技術(shù)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：腦膜炎奈瑟球菌的O-糖化修飾系統(tǒng) PilE PglL 大腸桿菌O157型O多糖基因簇 多糖-蛋白結(jié)合疫苗
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392;Q936
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 目錄8-10
• 第一章 引言10-13
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料13-19
• 2.1 菌株和質(zhì)粒13-14
• 2.2 工具酶、抗體及分子量標(biāo)準(zhǔn)14-15
• 2.3 主要試劑及試劑盒15
• 2.4 主要儀器15-16
• 2.5 主要培養(yǎng)基16-17
• 2.6 主要溶液17-19
• 第三章 實(shí)驗(yàn)方法19-56
• 3.1 引物設(shè)計(jì)19-20
• 3.2 宿主菌的構(gòu)建20-26
• 3.2.1 宿主菌的選擇20
• 3.2.2 利用Red重組技術(shù)敲除waaL基因20-26
• 3.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建26-49
• 3.3.1 菌毛蛋白PilE表達(dá)載體的構(gòu)建26-30
• 3.3.2 寡糖轉(zhuǎn)移酶PglL表達(dá)載體的構(gòu)建30-32
• 3.3.3 回補(bǔ)wbbL基因的寡糖轉(zhuǎn)移酶表達(dá)載體的構(gòu)建32-40
• 3.3.4 O157多糖基因簇表達(dá)載體的構(gòu)建40-49
• 3.4 重組表達(dá)載體菌株的構(gòu)建49-52
• 3.4.1 CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-wbbL-pglL重組菌的構(gòu)建49-50
• 3.4.2 CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-pglL/pACYC184-O157重組菌的構(gòu)建50-52
• 3.5 重組表達(dá)菌株的培養(yǎng)52-53
• 3.6 多糖-蛋白結(jié)合物的純化53-54
• 3.7 純化多糖-蛋白結(jié)合物的Westren印跡鑒定54-56
• 第四章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果56-68
• 4.1 宿主菌的成功構(gòu)建56
• 4.2 重組表達(dá)載體的成功構(gòu)建56-65
• 4.2.1 菌毛蛋白表達(dá)載體pMMB66EH-pilE-his的構(gòu)建56-57
• 4.2.2 寡糖轉(zhuǎn)移酶表達(dá)載體pETtac28-pglL的構(gòu)建57-58
• 4.2.3 含有寡糖轉(zhuǎn)移酶表達(dá)基因和大腸桿菌鼠李糖轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)載體pETtac28-wbbL-pglL的構(gòu)建58-61
• 4.2.4 O157多糖基因簇表達(dá)載體O157-pACYC184的構(gòu)建61-65
• 4.3 腦膜炎奈瑟球菌O-糖基化修飾系統(tǒng)在大腸桿菌中重構(gòu)65-66
• 4.4 O157多糖合成基因簇在大腸桿菌中的表達(dá)及其對(duì)菌毛蛋白PilE的修飾66-68
• 第五章 討論68-71
• 第六章 結(jié)論71-72
• 附錄72-77
• 1、宿主菌構(gòu)建原理圖72-73
• 2、以Red同源重組為基礎(chǔ)的基因敲除原理圖73
• 3、waaL基因序列73-74
• 4、ptac-wbbL-rrnB基因序列74-75
• 5、pilE基因序列75
• 6、pglL基因序列75-76
• 7、縮略詞表76-77
• 參考文獻(xiàn)77-82
• 致謝82

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 王恒

本文編號(hào)：391273