布魯氏菌�。˙rucellosis）是由革蘭氏陰性細(xì)菌布魯氏菌屬（Brucella）的病原菌感染而引起的一種人畜共患性動(dòng)物傳染疾病。人在感染該病后的主要癥狀是持續(xù)性發(fā)熱、關(guān)節(jié)炎、肝脾腫大等，動(dòng)物感染該病后除上述癥狀外，在反芻動(dòng)物中還常造成流產(chǎn)、不孕不育和組織壞死等嚴(yán)重的后果。進(jìn)入21世紀(jì)以來，布魯氏菌病在我國感染人數(shù)和發(fā)病率一直處于較高的位置，在畜牧業(yè)當(dāng)中也出現(xiàn)了明顯的區(qū)域感染回升現(xiàn)象。布魯氏菌病已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類身體健康和阻礙社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要因素之一。目前，布魯氏菌病在世界范圍內(nèi)尚無徹底治愈的先例，防控布魯氏菌病疫情的最有效措施依然是通過疫苗接種進(jìn)行免疫預(yù)防。 本文以布魯氏菌核糖體蛋白基因L7/L12和布魯氏菌2,4-二氧四氫蝶啶合酶基因bls為研究對(duì)象，以豬種布魯氏菌疫苗S2弱毒活疫苗菌株的全基因組DNA為模板，分別設(shè)計(jì)克隆引物和融合引物克隆目的基因L7/L12以及L7/L12和bls。將用融合引物克隆得到的L7/L12和bls基因片段利用融合PCR技術(shù)進(jìn)行融合，得到融合基因L7/L12-bls。將L7/L12基因插入到pET-28a質(zhì)粒載體中，構(gòu)建成功pET-28a-L7/L...

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 布魯氏菌概述
        1.1.1 布魯氏菌的發(fā)現(xiàn)歷史
        1.1.2 布魯氏菌的特性及分類
        1.1.3 布魯氏菌基因組研究概況
        1.1.4 布魯氏菌的感染機(jī)制
        1.1.5 布魯氏菌的病原學(xué)特性
        1.1.6 布魯氏菌病的傳播與流行
        1.1.7 我國布魯氏菌病疫情及危害
        1.1.8 布魯氏菌病的防治
    1.2 布魯氏菌的研究進(jìn)展
        1.2.1 布魯氏菌的致病性和調(diào)節(jié)系統(tǒng)
        1.2.2 布魯氏菌的免疫原性
        1.2.3 布魯氏菌的主要外膜抗原
        1.2.4 布魯氏菌的毒力相關(guān)因子
        1.2.5 布魯氏菌的核糖體蛋白基因（L7/L12）
        1.2.6 布魯氏菌的 2,4-二氧四氫蝶啶合成酶 BLS
        1.2.7 布魯氏菌病的診斷方法
    1.3 布魯氏菌病疫苗的研究進(jìn)展及研究意義
        1.3.1 畜牧業(yè)常用的傳統(tǒng)疫苗
        1.3.2 基因工程疫苗的研制與應(yīng)用
        1.3.3 布魯氏菌疫苗的研究意義
    1.4 本文的研究?jī)?nèi)容及研究意義
2 L7/L12 蛋白的制備與鑒定
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)器材
        2.1.1 試驗(yàn)中用到的基因工程酶類、試劑盒和菌株
        2.1.2 試驗(yàn)中用到主要實(shí)驗(yàn)試劑、藥品和器材
        2.1.3 本章實(shí)驗(yàn)所用試劑及配方
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 引物設(shè)計(jì)
        2.2.2 目的基因 L7/L12 的 PCR 擴(kuò)增純化與雙酶切
        2.2.3 pET-28a 質(zhì)粒載體的提取純化與雙酶切
        2.2.4 目的基因 L7/L12 克隆至 pET-28a 質(zhì)粒載體
        2.2.5 大腸桿菌克隆菌株 DH5α和表達(dá)菌株 TL129 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.6 重組質(zhì)粒 pET-28a-L7/L12 轉(zhuǎn)化 DH5α
        2.2.7 大腸桿菌 DH5α陽性克隆子的篩選與測(cè)序鑒定
        2.2.8 重組質(zhì)粒 pET-28a-L7/L12 的提取與雙酶切驗(yàn)證
        2.2.9 重組質(zhì)粒 pET-28a-L7/L12 導(dǎo)入 TL129 菌株及陽性克隆子篩選
        2.2.10 L7/L12 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定
        2.2.11 L7/L12 蛋白的純化
    2.3 試驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 引物設(shè)計(jì)結(jié)果
        2.3.2 目的基因 L7/L12 的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果
        2.3.3 pET-28a 質(zhì)粒的提取和雙酶切結(jié)果
        2.3.4 重組質(zhì)粒 pET-28a-L7/L12 的 DH5α陽性克隆子的菌落 PCR 篩選
        2.3.5 重組質(zhì)粒 pET-28a-L7/L12 的雙酶切檢測(cè)結(jié)果
        2.3.6 重組質(zhì)粒 pET-28a-L7/L12 堿基序列測(cè)定結(jié)果
        2.3.7 重組質(zhì)粒 pET-28a-L7/L12 的 TL129 陽性克隆子的菌落 PCR 篩選
        2.3.8 L7-L12 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定結(jié)果
        2.3.9 L7/L12 蛋白的純化結(jié)果
    2.4 結(jié)果和討論
3 L7/L12-BLS 融合蛋白的制備與鑒定
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)器材
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 引物設(shè)計(jì)
        3.2.2 目的基因 L7/L12 和 bls 的融合片段的 PCR 擴(kuò)增與純化
        3.2.3 目的基因 L7/L12 和 bls 的融合 PCR
        3.2.4 融合片段 L7/L2-bls 的純化與雙酶切
        3.2.5 pET-28a 質(zhì)粒載體的提取純化與雙酶切
        3.2.6 融合片段 L7/L12-bls 克隆至 pET-28a 質(zhì)粒載體
        3.2.7 重組質(zhì)粒 pET-28a-L7/L12-bls 轉(zhuǎn)化 DH5α
        3.2.8 大腸桿菌 DH5α-pET-28a-L7/L12-bls 陽性克隆子篩選保存與測(cè)序
        3.2.9 重組質(zhì)粒 pET-28a-L7/L12-bls 的提取與雙酶切驗(yàn)證
        3.2.10 重組質(zhì)粒pET-28a-L7/L12-bls轉(zhuǎn)化TL129表達(dá)菌株及陽性克隆子的篩選
        3.2.11 L7/L12-BLS 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定
        3.2.12 L7/L12-BLS 蛋白的純化
    3.3 試驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 引物設(shè)計(jì)結(jié)果
        3.3.2 L7/L12 和 bls 用融合引物的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果
        3.3.3 L7/L12 和 bls 的融合 PCR 及純化結(jié)果
        3.3.4 pET-28a 質(zhì)粒的提取和雙酶切結(jié)果
        3.3.5 pET-28a-L7/L12-bls 轉(zhuǎn)化 DH5α陽性克隆子的篩選結(jié)果
        3.3.6 重組質(zhì)粒 pET-28a-L7/L12-bls 的提取及雙酶切檢測(cè)結(jié)果
        3.3.7 重組質(zhì)粒 pET-28a-L7/L12-bls 堿基序列測(cè)定結(jié)果
        3.3.8 pET-28a-L7/L12-bls 轉(zhuǎn)化 TL129 陽性克隆子篩選結(jié)果
        3.3.9 L7/L12-BLS 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定結(jié)果
        3.3.10 L7/L12-BLS 蛋白的純化結(jié)果
    3.4 結(jié)果和討論
4 L7/L12 蛋白和 L7/L12-BLS 融合蛋白的免疫原性研究
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)器材
        4.1.1 主要試劑配方和實(shí)驗(yàn)器材
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其處理
    4.2 試驗(yàn)方法
        4.2.1 L7/L12 蛋白和 L7/L12-BLS 融合蛋白免疫長耳家兔
        4.2.2 L7/L12 免疫血清和 L7/L12-BLS 免疫血清以及正常血清的提取
        4.2.3 免疫血清的 Western blot 檢測(cè)
        4.2.4 免疫血清的 ELISA 檢測(cè)
    4.3 試驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 免疫血清 Western blot 檢測(cè)結(jié)果
        4.3.2 免疫血清 ELISA 檢測(cè)結(jié)果
    4.4 結(jié)果及討論
參考文獻(xiàn)
在校研究成果
致謝



本文編號(hào)：3838795