細胞衰老和自噬是細胞對應激的兩種應答方式，它們之間存在一定的聯(lián)系。越來越多的證據(jù)表明自噬可以調節(jié)細胞衰老并且影響細胞的壽命。有研究發(fā)現(xiàn)Caffeine在酵母菌和哺乳動物細胞中能誘導自噬，并且Caffeine被報道具有延長酵母菌壽命和緩解細胞衰老的作用。但是目前并不清楚Caffeine緩解細胞衰老的作用是否與其誘導自噬的作用有關。據(jù)此，本論文將考察Caffeine緩解細胞衰老的作用與自噬之間的關系，并進一步探討Caffeine誘導自噬的分子機制。 首先，使用自由基誘導劑AAPH作用于A375細胞誘導細胞發(fā)生衰老，建立氧化應激誘導的細胞衰老模型，并在此模型的基礎上考察Caffeine緩解細胞衰老的效果。采用MTT法和流式細胞術分別檢測細胞的增殖抑制率和ROS生成量及線粒體膜電位，實驗結果發(fā)現(xiàn)AAPH呈時間濃度依賴性抑制A375細胞增殖，抗氧化劑NAC能緩解AAPH對細胞的增殖抑制作用。結果也顯示AAPH呈時間濃度依賴性增加細胞內ROS生成并降低線粒體膜電位。通過衰老相關β-半乳糖苷酶染色、western blotting及激光共聚焦顯微技術檢測細胞衰老相關的指標，實驗結果顯示1mM AAP...

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
英文縮略詞表
目錄
1 前言
    1.1 細胞衰老
        1.1.1 衰老細胞的特點
        1.1.2 導致細胞衰老的因素及細胞衰老的分類
        1.1.3 細胞衰老與組織老化的關系
    1.2 自噬與細胞衰老
        1.2.1 自噬的概述及其生理功能
        1.2.2 自噬與衰老的關系
    1.3 SIRT3
        1.3.1 SIRT3 的概述
        1.3.2 SIRT3 與衰老的關系
        1.3.3 SIRT3 與自噬的關系
    1.4 Caffeine
        1.4.1 Caffeine 的生理作用
        1.4.2 Caffeine 與衰老的關系
        1.4.3 Caffeine 與自噬的關系
    1.5 立體依據(jù)
2 Caffeine 緩解 AAPH 誘導的 A375 細胞衰老
    2.1 材料與方法
        2.1.1 主要試劑與材料
        2.1.2 細胞培養(yǎng)
        2.1.3 MTT 法測定細胞增殖抑制率
        2.1.4 ROS 生成量的檢測
        2.1.5 線粒體膜電位的檢測
        2.1.6 衰老相關的β‐半乳糖苷酶染色
        2.1.7 Western blotting 檢測蛋白表達
        2.1.8 激光共聚焦顯微鏡檢測衰老相關異染色質位點及相關蛋白共定位
        2.1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
    2.2 實驗結果
        2.2.1 AAPH 抑制 A375 細胞增殖
        2.2.2 AAPH 對細胞內 ROS 生成的影響
        2.2.3 AAPH 對細胞線粒體膜電位的影響
        2.2.4 衰老相關的β‐半乳糖苷酶染色法檢測衰老細胞
        2.2.5 AAPH 對 A375 細胞內 p53、p‐p53 和 p21 蛋白表達的影響
        2.2.6 AAPH 誘導了衰老相關異染色質位點的形成
        2.2.7 Caffeine 緩解 AAPH 對 A375 細胞的增殖抑制作用
        2.2.8 Caffeine 減少 AAPH 所致細胞衰老
        2.2.9 Caffeine 減少 AAPH 處理的細胞中的 p53 蛋白磷酸化和 p21 蛋白表達
    2.3 小結與討論
3 Caffeine 通過誘導自噬緩解氧化應激導致的細胞衰老
    3.1 材料與方法
        3.1.1 主要試劑與材料
        3.1.2 細胞培養(yǎng)
        3.1.3 激光共聚焦顯微鏡檢測自噬小體及相關蛋白共定位
        3.1.4 Western blotting 檢測蛋白表達
        3.1.5 透射電子顯微鏡觀察細胞的自噬結構
        3.1.6 線粒體膜電位的檢測
        3.1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
    3.2 實驗結果
        3.2.1 Caffeine 增加細胞內的自噬小體
        3.2.2 Caffeine 增加了 AAPH 處理的細胞的自噬相關蛋白表達
        3.2.3 透射電子顯微鏡觀察 Caffeine 誘導自噬的情況
        3.2.4 自噬水平提高對 AAPH 處理的細胞中的 p53 磷酸化和 p21 表達的影響
        3.2.5 自噬水平提高對 AAPH 處理的細胞中的線粒體膜電位的影響
    3.3 小結與討論
4 Caffeine 通過拮抗 A2A 受體而激活 SIRT3/AMPK 信號通路進而誘導自噬
    4.1 材料與方法
        4.1.1 主要試劑與材料
        4.1.2 細胞培養(yǎng)
        4.1.3 Western blotting 檢測蛋白表達
        4.1.4 激光共聚焦顯微鏡檢測衰老相關異染色質位點及相關蛋白共定位
        4.1.5 siRNA 轉染實驗
        4.1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
    4.2 實驗結果
        4.2.1 Caffeine 及 A2A 腺苷受體對 AAPH 處理的細胞中 SIRT3 蛋白表達和 AMPK 蛋白磷酸化的影響
        4.2.2 A2A 腺苷受體對 AAPH 處理的細胞中自噬相關蛋白表達的影響
        4.2.3 A2A 受體對 AAPH 處理的細胞中 p53 蛋白磷酸化和 p21 蛋白表達的影響
        4.2.4 Caffeine 及 A2A 受體對 AAPH 處理的細胞中衰老相關異染色質位點形成的影響
        4.2.5 SIRT3 siRNA 轉染效率及 SIRT3 沉默對 AMPK 磷酸化的影響
        4.2.6 SIRT3 沉默對自噬相關蛋白表達的影響
        4.2.7 SIRT3 沉默對 p53 磷酸化和 p21 表達的影響
    4.3 小結與討論
5 結論和展望
    5.1 結論
    5.2 創(chuàng)新和突破
    5.3 展望
參考文獻
致謝
在學期間發(fā)表論文



本文編號：3792624