細(xì)胞衰老和自噬是細(xì)胞對應(yīng)激的兩種應(yīng)答方式，它們之間存在一定的聯(lián)系。越來越多的證據(jù)表明自噬可以調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老并且影響細(xì)胞的壽命。有研究發(fā)現(xiàn)Caffeine在酵母菌和哺乳動物細(xì)胞中能誘導(dǎo)自噬，并且Caffeine被報道具有延長酵母菌壽命和緩解細(xì)胞衰老的作用。但是目前并不清楚Caffeine緩解細(xì)胞衰老的作用是否與其誘導(dǎo)自噬的作用有關(guān)。據(jù)此，本論文將考察Caffeine緩解細(xì)胞衰老的作用與自噬之間的關(guān)系，并進(jìn)一步探討Caffeine誘導(dǎo)自噬的分子機制。 首先，使用自由基誘導(dǎo)劑AAPH作用于A375細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生衰老，建立氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老模型，并在此模型的基礎(chǔ)上考察Caffeine緩解細(xì)胞衰老的效果。采用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測細(xì)胞的增殖抑制率和ROS生成量及線粒體膜電位，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)AAPH呈時間濃度依賴性抑制A375細(xì)胞增殖，抗氧化劑NAC能緩解AAPH對細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果也顯示AAPH呈時間濃度依賴性增加細(xì)胞內(nèi)ROS生成并降低線粒體膜電位。通過衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色、western blotting及激光共聚焦顯微技術(shù)檢測細(xì)胞衰老相關(guān)的指標(biāo)，實驗結(jié)果顯示1mM AAP...

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
英文縮略詞表
目錄
1 前言
    1.1 細(xì)胞衰老
        1.1.1 衰老細(xì)胞的特點
        1.1.2 導(dǎo)致細(xì)胞衰老的因素及細(xì)胞衰老的分類
        1.1.3 細(xì)胞衰老與組織老化的關(guān)系
    1.2 自噬與細(xì)胞衰老
        1.2.1 自噬的概述及其生理功能
        1.2.2 自噬與衰老的關(guān)系
    1.3 SIRT3
        1.3.1 SIRT3 的概述
        1.3.2 SIRT3 與衰老的關(guān)系
        1.3.3 SIRT3 與自噬的關(guān)系
    1.4 Caffeine
        1.4.1 Caffeine 的生理作用
        1.4.2 Caffeine 與衰老的關(guān)系
        1.4.3 Caffeine 與自噬的關(guān)系
    1.5 立體依據(jù)
2 Caffeine 緩解 AAPH 誘導(dǎo)的 A375 細(xì)胞衰老
    2.1 材料與方法
        2.1.1 主要試劑與材料
        2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.1.3 MTT 法測定細(xì)胞增殖抑制率
        2.1.4 ROS 生成量的檢測
        2.1.5 線粒體膜電位的檢測
        2.1.6 衰老相關(guān)的β‐半乳糖苷酶染色
        2.1.7 Western blotting 檢測蛋白表達(dá)
        2.1.8 激光共聚焦顯微鏡檢測衰老相關(guān)異染色質(zhì)位點及相關(guān)蛋白共定位
        2.1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
    2.2 實驗結(jié)果
        2.2.1 AAPH 抑制 A375 細(xì)胞增殖
        2.2.2 AAPH 對細(xì)胞內(nèi) ROS 生成的影響
        2.2.3 AAPH 對細(xì)胞線粒體膜電位的影響
        2.2.4 衰老相關(guān)的β‐半乳糖苷酶染色法檢測衰老細(xì)胞
        2.2.5 AAPH 對 A375 細(xì)胞內(nèi) p53、p‐p53 和 p21 蛋白表達(dá)的影響
        2.2.6 AAPH 誘導(dǎo)了衰老相關(guān)異染色質(zhì)位點的形成
        2.2.7 Caffeine 緩解 AAPH 對 A375 細(xì)胞的增殖抑制作用
        2.2.8 Caffeine 減少 AAPH 所致細(xì)胞衰老
        2.2.9 Caffeine 減少 AAPH 處理的細(xì)胞中的 p53 蛋白磷酸化和 p21 蛋白表達(dá)
    2.3 小結(jié)與討論
3 Caffeine 通過誘導(dǎo)自噬緩解氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞衰老
    3.1 材料與方法
        3.1.1 主要試劑與材料
        3.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.1.3 激光共聚焦顯微鏡檢測自噬小體及相關(guān)蛋白共定位
        3.1.4 Western blotting 檢測蛋白表達(dá)
        3.1.5 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞的自噬結(jié)構(gòu)
        3.1.6 線粒體膜電位的檢測
        3.1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
    3.2 實驗結(jié)果
        3.2.1 Caffeine 增加細(xì)胞內(nèi)的自噬小體
        3.2.2 Caffeine 增加了 AAPH 處理的細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)
        3.2.3 透射電子顯微鏡觀察 Caffeine 誘導(dǎo)自噬的情況
        3.2.4 自噬水平提高對 AAPH 處理的細(xì)胞中的 p53 磷酸化和 p21 表達(dá)的影響
        3.2.5 自噬水平提高對 AAPH 處理的細(xì)胞中的線粒體膜電位的影響
    3.3 小結(jié)與討論
4 Caffeine 通過拮抗 A2A 受體而激活 SIRT3/AMPK 信號通路進(jìn)而誘導(dǎo)自噬
    4.1 材料與方法
        4.1.1 主要試劑與材料
        4.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        4.1.3 Western blotting 檢測蛋白表達(dá)
        4.1.4 激光共聚焦顯微鏡檢測衰老相關(guān)異染色質(zhì)位點及相關(guān)蛋白共定位
        4.1.5 siRNA 轉(zhuǎn)染實驗
        4.1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
    4.2 實驗結(jié)果
        4.2.1 Caffeine 及 A2A 腺苷受體對 AAPH 處理的細(xì)胞中 SIRT3 蛋白表達(dá)和 AMPK 蛋白磷酸化的影響
        4.2.2 A2A 腺苷受體對 AAPH 處理的細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
        4.2.3 A2A 受體對 AAPH 處理的細(xì)胞中 p53 蛋白磷酸化和 p21 蛋白表達(dá)的影響
        4.2.4 Caffeine 及 A2A 受體對 AAPH 處理的細(xì)胞中衰老相關(guān)異染色質(zhì)位點形成的影響
        4.2.5 SIRT3 siRNA 轉(zhuǎn)染效率及 SIRT3 沉默對 AMPK 磷酸化的影響
        4.2.6 SIRT3 沉默對自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
        4.2.7 SIRT3 沉默對 p53 磷酸化和 p21 表達(dá)的影響
    4.3 小結(jié)與討論
5 結(jié)論和展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 創(chuàng)新和突破
    5.3 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
在學(xué)期間發(fā)表論文



本文編號：3792624