本文關(guān)鍵詞：用于藥物篩選的mGluR2突變體和用于失敏機(jī)制研究的mGluR5突變體的構(gòu)建及其功能檢測(cè)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptors,mGluRs)屬于C族GPCRs，其功能異�？蓪�(dǎo)致老年癡呆癥，焦慮，，沮喪，精神分裂癥等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。mGluRs在體內(nèi)為同源二聚體，每個(gè)單體都包括與配體結(jié)合的VFT區(qū)(Venusflytrap module)，七次跨膜區(qū)（heptahelical domain,HD）、連接VFT與HD區(qū)的富含半胱氨酸區(qū)（Cys-rich domain, CRD）以及胞內(nèi)的C末端。mGluRs的活性和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到配體和變構(gòu)劑的調(diào)控,它操作性較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)和重要的生理功能使之成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要藥物靶點(diǎn)。除了受到外源性配體的調(diào)控，mGluRs的信號(hào)活性及轉(zhuǎn)導(dǎo)也受到細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)蛋白的調(diào)控。 負(fù)向變構(gòu)劑(Positive Allosteric Modulator, PAM)類藥物的低毒性和高種屬特異性使它成為近年來(lái)藥物研發(fā)的熱點(diǎn)，但因其研發(fā)過(guò)程需要加入激動(dòng)劑和PAM兩種化合物，這所帶來(lái)的高工作量及高信噪比給研發(fā)帶來(lái)了困難。而去除VFT區(qū)的mGluRs可以被PAM單獨(dú)激活，以此模型篩選藥物無(wú)疑大大降低的工作量和信噪比。由于不同的受體偶聯(lián)不同的信號(hào)通路，所以傳統(tǒng)的藥物篩選方法具有較低的普適性。這里我們通過(guò)去除VFT區(qū)并插入SNAP/CLIP標(biāo)簽的mGluR2的突變體來(lái)建立篩選PAM類的候選細(xì)胞模型。VFT區(qū)的去除避免了篩選PAM過(guò)程中需要加入激動(dòng)劑帶來(lái)的額外工作量和高信噪比，而使用基于SNAP/CLIP的TR-FRET避免了檢測(cè)不同下游信號(hào)通路帶來(lái)的低普適性。這里我們構(gòu)建了去除VFT區(qū)的一系列候選細(xì)胞模型，包括VFT區(qū)或CRD區(qū)的去除，mGluR2的N端和e2-loop的SNAP/CLIP標(biāo)簽的插入以及C1KKXX，C2KKXX尾巴的替換。鑒于各突變可能會(huì)對(duì)受體的表達(dá)量尤其是膜表達(dá)量產(chǎn)生影響，我們檢測(cè)了各個(gè)突變體的表達(dá)情況。另外，我并確定了去除VFT而保留CRD的突變體具有功能，并且其信號(hào)強(qiáng)度高于同時(shí)去除VFT和CRD的突變體的。 根據(jù)報(bào)道，GRK2介導(dǎo)的mGluR1的脫敏需要mGluR1，Gαq和GRK2三者的相互作用。這里我們利用GRK2的突變體RH,PH,D110A等證明了單獨(dú)的RH結(jié)構(gòu)域的表達(dá)即可介導(dǎo)mGluR5的脫敏，這說(shuō)明是GRK2的RH結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)mGluR5的脫敏。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)失去和mGluR5結(jié)合能力的D110A不能介導(dǎo)mGluR5的脫敏，這說(shuō)明GRK2與Gαq的直接相互作用是GRK2介導(dǎo)mGluR5脫敏的必要條件。另外，我們利用GRK2的突變體D527A證明GRK2介導(dǎo)的mGluR5脫敏不需要GRK2的PH區(qū)與mGluR5相互作用。同時(shí)利用mGluR5的i2-loop突變體K677A, K678A, K679A,KAA, AAA,證明GRK2介導(dǎo)的mGluR5不需要mGluR5的i2-loop和GRK2相互作用。這說(shuō)明與mGlu1不同，GRK2介導(dǎo)mGluR5的脫敏不需要i2-loop與GRK2的直接相互作用。
【關(guān)鍵詞】：mGluR2 TR-FRET SNAP GPCR GRK2 mGluR5 磷酸化 脫敏
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 緒論10-29
• 1.1 mGluRs 的結(jié)構(gòu)10-12
• 1.2 mGluRs 的分布和功能12-13
• 1.3 變構(gòu)劑具有理想的臨床潛力13-14
• 1.4 篩選 PAM 的必要性以及困難14-15
• 1.5 使用ΔV-mGluRs 作為 PAM 的篩選模型可提高信噪比并減小工作量15
• 1.6 基于 SNAP 標(biāo)記的 TR-FRET 是新的廣譜高通量篩選方法15-17
• 1.7 TR-FRET 技術(shù)17-20
• 1.8 GPCR 的脫敏20-22
• 1.9 G 蛋白偶聯(lián)受體激酶簡(jiǎn)介22-23
• 1.10 GRK2 介導(dǎo)的 mGluR1 的非磷酸化依賴型脫敏23-25
• 1.11 mGluR1 的內(nèi)吞25-26
• 1.12 課題研究的意義26-29
• 2 實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理29-33
• 2.1 定點(diǎn)突變29
• 2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染29-30
• 2.3 ELISA30
• 2.4 IP3 檢測(cè)30-31
• 2.5 鈣流實(shí)驗(yàn)31
• 2.6 TR-FRET31-32
• 2.7 數(shù)據(jù)處理32-33
• 3 用于藥物篩選的 mGluR2 突變體的構(gòu)建33-50
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法33-37
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-47
• 3.3 討論47-50
• 4 用于失敏機(jī)制研究的 mGluR5 突變體的構(gòu)建及其功能檢測(cè)50-62
• 4.1 材料與方法50-53
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-59
• 4.3 討論59-62
• 致謝62-63
• 參考文獻(xiàn)63-69
• 附錄 主要符號(hào)和縮略詞表69

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：374288