骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的發(fā)現(xiàn)證實了骨形成的誘 導(dǎo)學(xué)說，為難治性骨折和骨缺損的治療提供新的希望。從1988年Wozney首次 克隆人BMP cDNA基因，至今已發(fā)現(xiàn)近20種人BMP。BMP屬于TGF-β超家族 成員，不僅在骨骼的發(fā)育和再生修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且在中胚層的誘導(dǎo) 和分化、造血組織的形成和發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和修復(fù)等方面都起著重要 作用。因而對BMP的研究不僅有重要的理論意義，而且還具有廣闊的臨床應(yīng) 用前景。從骨組織提取BMP，方法煩瑣、收獲量少、純度低、重復(fù)性差，因 此，用基因工程制備BMP就成為將BMP推向應(yīng)用的必然途徑。國內(nèi)外在COS、 CHO、昆蟲等真核細胞中已經(jīng)表達得到不同種人BMP，但表達量低，成本昂 貴；我研究組率先在大腸桿菌中高表達獲得具誘骨活性的人BMP-2和-3羧基 端肽，為BMP的研究和應(yīng)用提供了新來源。 然而BMP的研究和應(yīng)用遇到了一大難題——至今還沒有理想的定量測 定BMP生物學(xué)活性的方法，這大大限制了BMP臨床應(yīng)用的進度。目前國內(nèi) 外對BMP的測活，基本上還是沿用Urist最早采用的體內(nèi)植...

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【學(xué)位級別】：博士

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文獻綜述
    一、 BMP研究進展
    二、 成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子Cbfal
前言
實驗部分
    第一部分 rhBMP2成骨分化作用的研究
        實驗材料
        實驗方法
            一、 rhBMP的表達制備
            二、 rhBMP誘骨活性實驗
            三、 細胞培養(yǎng)
            四、 ALP活性測定
            五、 OC含量的測定
            六、 細胞蛋白質(zhì)含量測定
            七、 MTT法測定細胞活性
        實驗結(jié)果
            一、 rhBMP純化結(jié)果
            二、 rhBMP2誘骨組織學(xué)觀察
            三、 ALP測定結(jié)果
            四、 OC含量測定
            五、 細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量測定
            六、 rhBMP2對細胞增殖的影響
        討 論
            一、 關(guān)于BMP誘骨活性及其應(yīng)用前景
            二、 關(guān)于BMP的活性檢測
    第二部分 rhBMP定量測活方法的建立
        實驗材料
        實驗方法
            一、 RNA提取
            二、 反轉(zhuǎn)錄
            三、 細胞基因組DNA提取
            四、 PCR
            五、 質(zhì)粒提取、細菌轉(zhuǎn)化及電泳等
            六、 細胞轉(zhuǎn)染
            七、 抗性細胞的篩選
            八、 單克隆細胞的挑選
            九、 單克隆細胞穩(wěn)定性檢驗
            十、 Luciferase活性測定
            十一、 核酸雜交
            十二、 rhBMP-2m誘骨活性比較
        實驗結(jié)果
            一、 RT-PCR或PCR
            二、 序列分析
            三、 載體構(gòu)建
            四、 載體Luciferase基礎(chǔ)活性的測定
            五、 不同細胞克隆Luciferase活性比較
            六、 單克隆細胞生長特性
            七、 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克隆細胞的鑒定
            八、 不同單克隆細胞對rhBMP-2反應(yīng)性
            九、 不同種rhBMP活性比較
            十、 不同方法復(fù)性的rhBMP-2活性比較
            十一、 rhBMP-2與rhBMP-2對照品比較
            十二、 不同細胞因子對單克隆細胞Luciferase活性影響
            十三、 不同方法復(fù)性rhBMP-2誘骨的組織學(xué)觀察
        討 論
            一、 關(guān)于Luciferase報告基因系統(tǒng)
            二、 關(guān)于基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染與外源基因整合穩(wěn)定性問題
            三、 關(guān)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克隆細胞用于rhBMP測活的問題
小結(jié)
參考文獻
致謝



本文編號：3739949