骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的發(fā)現(xiàn)證實(shí)了骨形成的誘 導(dǎo)學(xué)說(shuō)，為難治性骨折和骨缺損的治療提供新的希望。從1988年Wozney首次 克隆人BMP cDNA基因，至今已發(fā)現(xiàn)近20種人BMP。BMP屬于TGF-β超家族 成員，不僅在骨骼的發(fā)育和再生修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且在中胚層的誘導(dǎo) 和分化、造血組織的形成和發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和修復(fù)等方面都起著重要 作用。因而對(duì)BMP的研究不僅有重要的理論意義，而且還具有廣闊的臨床應(yīng) 用前景。從骨組織提取BMP，方法煩瑣、收獲量少、純度低、重復(fù)性差，因 此，用基因工程制備BMP就成為將BMP推向應(yīng)用的必然途徑。國(guó)內(nèi)外在COS、 CHO、昆蟲(chóng)等真核細(xì)胞中已經(jīng)表達(dá)得到不同種人BMP，但表達(dá)量低，成本昂 貴；我研究組率先在大腸桿菌中高表達(dá)獲得具誘骨活性的人BMP-2和-3羧基 端肽，為BMP的研究和應(yīng)用提供了新來(lái)源。 然而B(niǎo)MP的研究和應(yīng)用遇到了一大難題——至今還沒(méi)有理想的定量測(cè) 定BMP生物學(xué)活性的方法，這大大限制了BMP臨床應(yīng)用的進(jìn)度。目前國(guó)內(nèi) 外對(duì)BMP的測(cè)活，基本上還是沿用Urist最早采用的體內(nèi)植...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
英文縮寫詞表
中文摘要
英文摘要
文獻(xiàn)綜述
    一、 BMP研究進(jìn)展
    二、 成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子Cbfal
前言
實(shí)驗(yàn)部分
    第一部分 rhBMP2成骨分化作用的研究
        實(shí)驗(yàn)材料
        實(shí)驗(yàn)方法
            一、 rhBMP的表達(dá)制備
            二、 rhBMP誘骨活性實(shí)驗(yàn)
            三、 細(xì)胞培養(yǎng)
            四、 ALP活性測(cè)定
            五、 OC含量的測(cè)定
            六、 細(xì)胞蛋白質(zhì)含量測(cè)定
            七、 MTT法測(cè)定細(xì)胞活性
        實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            一、 rhBMP純化結(jié)果
            二、 rhBMP2誘骨組織學(xué)觀察
            三、 ALP測(cè)定結(jié)果
            四、 OC含量測(cè)定
            五、 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量測(cè)定
            六、 rhBMP2對(duì)細(xì)胞增殖的影響
        討 論
            一、 關(guān)于BMP誘骨活性及其應(yīng)用前景
            二、 關(guān)于BMP的活性檢測(cè)
    第二部分 rhBMP定量測(cè)活方法的建立
        實(shí)驗(yàn)材料
        實(shí)驗(yàn)方法
            一、 RNA提取
            二、 反轉(zhuǎn)錄
            三、 細(xì)胞基因組DNA提取
            四、 PCR
            五、 質(zhì)粒提取、細(xì)菌轉(zhuǎn)化及電泳等
            六、 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            七、 抗性細(xì)胞的篩選
            八、 單克隆細(xì)胞的挑選
            九、 單克隆細(xì)胞穩(wěn)定性檢驗(yàn)
            十、 Luciferase活性測(cè)定
            十一、 核酸雜交
            十二、 rhBMP-2m誘骨活性比較
        實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            一、 RT-PCR或PCR
            二、 序列分析
            三、 載體構(gòu)建
            四、 載體Luciferase基礎(chǔ)活性的測(cè)定
            五、 不同細(xì)胞克隆Luciferase活性比較
            六、 單克隆細(xì)胞生長(zhǎng)特性
            七、 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克隆細(xì)胞的鑒定
            八、 不同單克隆細(xì)胞對(duì)rhBMP-2反應(yīng)性
            九、 不同種rhBMP活性比較
            十、 不同方法復(fù)性的rhBMP-2活性比較
            十一、 rhBMP-2與rhBMP-2對(duì)照品比較
            十二、 不同細(xì)胞因子對(duì)單克隆細(xì)胞Luciferase活性影響
            十三、 不同方法復(fù)性rhBMP-2誘骨的組織學(xué)觀察
        討 論
            一、 關(guān)于Luciferase報(bào)告基因系統(tǒng)
            二、 關(guān)于基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染與外源基因整合穩(wěn)定性問(wèn)題
            三、 關(guān)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克隆細(xì)胞用于rhBMP測(cè)活的問(wèn)題
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3739949