發(fā)布時間：2022-07-11 11:28

　　本研究以番茄子葉和下胚軸為材料，以Gus瞬時表達(dá)效率為指標(biāo)，系統(tǒng)研究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素，在此基礎(chǔ)上建立并優(yōu)化了番茄“羞女”品種的遺傳轉(zhuǎn)化體系；構(gòu)建乙型肝炎病毒表面抗原基因（HBsAg）、戊型肝炎病毒ORF₂基因片段NE₂（HEV-NE₂）的植物表達(dá)載體，利用已建立的轉(zhuǎn)化體系將其導(dǎo)入番茄，獲得了經(jīng)PCR和Southern雜交證實(shí)的轉(zhuǎn)基因植株。ELISA檢測結(jié)果顯示在番茄中表達(dá)的目的蛋白具有較好的免疫活性；動物試驗(yàn)結(jié)果初步表明，用轉(zhuǎn)基因番茄表達(dá)的HBsAg口服或肌注初免過的小鼠，均有不同程度的加強(qiáng)免疫效果。展示了用番茄研制乙肝、戊肝口服疫苗的美好前景，為推動轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗走向?qū)嵱没峁⿲?shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)。 1．植物表達(dá)載體構(gòu)建：利用含GUS和去GUS的中間載體pCAMBIA1301和pCAMBIA1300構(gòu)建了乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、戊肝病毒ORF₂基因片段NE₂的植物表達(dá)載體p1301HBs、p1300HBs、p1301NE₂

【文章頁數(shù)】：104 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
目錄
中文摘要
英文摘要
前言
    1 轉(zhuǎn)基因植物的研究及其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展
        1.1 轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)越性
        1.2 轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)化方法
        1.3 轉(zhuǎn)基因植物研究進(jìn)展
        1.4 轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀
        1.5 轉(zhuǎn)基因植物領(lǐng)域中存在的問題
    2 轉(zhuǎn)基因番茄研究進(jìn)展
        2.1 番茄品種改良的基因工程研究概況
        2.2 利用轉(zhuǎn)基因番茄生產(chǎn)藥用蛋白的研究
    3 植物基因工程疫苗的研究進(jìn)展
        3.1 轉(zhuǎn)基因植物疫苗的表達(dá)系統(tǒng)
        3.2 幾種主要轉(zhuǎn)基因植物疫苗的研究概況
        3.3 轉(zhuǎn)基因植物疫苗中存在的問題及相應(yīng)對策
    4 肝炎病毒疫苗的研究進(jìn)展
        4.1 乙型肝炎病毒疫苗
        4.2 戊型肝炎病毒疫苗
    5 本研究的目的、意義和研究內(nèi)容
材料和方法
    1 材料
    2 方法
結(jié)果與分析
    1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
    2 雙元質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的鑒定
    3 番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化
        3.1 外植體接種后形態(tài)變化
        3.2 不同部位外植體形成愈傷組織的差異
        3.3 不同培養(yǎng)基對愈傷組織和不定芽形成的影響
        3.4 番茄外植體對抗生素的敏感性試驗(yàn)
        3.5 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化
        3.6 優(yōu)化條件下的轉(zhuǎn)化流程及抗性苗的獲得
    4 外源基因整合、表達(dá)的檢測
        4.1 報告基因（GUS）檢測結(jié)果
        4.2 目的基因PCR檢測
        4.3 Southern雜交
        4.4 轉(zhuǎn)化植株中目的基因表達(dá)活性及表達(dá)量的檢測
            4.4.1 植物外源蛋白HBsAg的ELISA活性檢測及定量
            4.4.2 植物外源蛋白HEV-NE2的ELISA活性檢測
    5 轉(zhuǎn)基因植物的擴(kuò)繁與移栽
    6 轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的HBsAg的免疫原性
        6.1 植物蛋白粗提液的分離、純化
        6.2 小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果
討論
    1 關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物中的報告基因—GUS基因
        1.1 Gus作為報告基因的可靠性
        1.2 Gus基因的安全性
    2 轉(zhuǎn)基因植物中基因沉默問題及改進(jìn)措施
        2.1 轉(zhuǎn)基因沉默的機(jī)制
        2.2 防止基因沉默的對策
    3 轉(zhuǎn)基因苗擴(kuò)繁中培養(yǎng)物的褐化問題
    4 小鼠免疫試驗(yàn)中存在的問題及改進(jìn)措施
    5 番茄做為乙肝、戊肝植物口服疫苗的前景
    6 植物口服疫苗產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的建議
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]果樹轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展[J]. 林順權(quán),宋剛,馬英,曾黎輝,呂柳新.  園藝學(xué)報. 2001(S1)
[2]轉(zhuǎn)基因植物的現(xiàn)狀[J]. 王亮,游松.  沈陽藥科大學(xué)學(xué)報. 2001(03)
[3]我國研制成功戊型肝炎疫苗[J]. 靈曉.  中華醫(yī)學(xué)雜志. 2001(02)
[4]戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)區(qū)基因ORF2在Pichia pastoris中的分泌表達(dá)[J]. 佟玉品,畢勝利,張明程,魯健,詹美云.  中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志. 2000(04)
[5]轉(zhuǎn)基因植物中報告基因gus的表達(dá)及其安全性評價[J]. 王忠華,夏英武.  生命科學(xué). 2000(05)
[6]轉(zhuǎn)基因植物的研究及其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展[J]. 曹孟良.  湖南農(nóng)業(yè)科學(xué). 2000(04)
[7]含與不含前導(dǎo)序列的乙肝病毒表面抗原在轉(zhuǎn)基因番茄中表達(dá)的研究[J]. 趙春暉,王榮,趙長生,王關(guān)林,田波.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報. 2000(02)
[8]農(nóng)業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展問題的思考[J]. 黃其滿.  高技術(shù)通訊. 2000(06)
[9]轉(zhuǎn)基因番茄防齲疫苗的基礎(chǔ)研究 Ⅰ.變形鏈球菌pac基因唾液粘附區(qū)植物表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建[J]. 蔣少云,凌均啟.  口腔醫(yī)學(xué)縱橫. 2000(02)
[10]迎接21世紀(jì)農(nóng)作物生物技術(shù)的挑戰(zhàn)[J]. 范云六,張春義.  生物技術(shù)通報. 1999(05)



本文編號：3658080