本文關(guān)鍵詞：Notch信號(hào)調(diào)控ROS產(chǎn)生對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【研究背景】 血管生成是一個(gè)涉及內(nèi)皮細(xì)胞（ECS）、平滑肌細(xì)胞（SMC）協(xié)同作用的多步驟多環(huán)節(jié)的過(guò)程。在VEGF等促血管生成因子的刺激下，，血管內(nèi)皮細(xì)胞從原有的血管萌出，不斷增殖，遷移，分化以形成新的血管，隨后募集周細(xì)胞包被新生血管，促進(jìn)其成熟。Notch信號(hào)通路在血管生成中具有重要的作用，可通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，遷移或者分化以及平滑肌細(xì)胞的募集進(jìn)而調(diào)控血管生成。如以γ-分泌酶抑制劑（GSI）阻斷Notch信號(hào)通路或者在血管內(nèi)皮細(xì)胞上敲除Notch的配體DLL4或者Notch1均可導(dǎo)致血管生成中tip細(xì)胞數(shù)量增加。另外，Notch信號(hào)途徑也被報(bào)道在維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的作用。然而，Notch信號(hào)如何調(diào)控新生血管形成的分子機(jī)制，尚未完全清楚。 目前，大量文獻(xiàn)報(bào)道，活性氧簇（Reactive oxygen species, ROS）主要包括過(guò)氧化氫和超氧陰離子等活性氧分子，它在細(xì)胞的生理和病理狀態(tài)下均發(fā)揮重要作用。低濃度的ROS可作為信號(hào)分子，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，并調(diào)節(jié)體內(nèi)血管生成。NADPH氧化酶家族（NOX）是由多個(gè)亞基組成的酶復(fù)合體，其主要包括:位于胞膜的細(xì)胞色素b558（gp91phox和p22phox）和位于胞漿的p67phox、p47phox、及Rac（小GTP結(jié)合蛋白）等五個(gè)亞基。p22phox和gp91phox是NOX的酶促核心成員，它們受Rac及p47phox的調(diào)節(jié)。近年來(lái)在對(duì)各種組織的研究中發(fā)現(xiàn)：NOX共有5種同源家族體，分別稱為NOX1、NOX2、NOX3、NOX4和NOX5，其分別表達(dá)在不同組織中，血管內(nèi)皮細(xì)胞主要表達(dá)NOX2和NOX4。許多刺激因素，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，缺氧和缺血再灌注（I/R），可通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞NADPH氧化酶的活性，增加細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，產(chǎn)生的ROS可通過(guò)抑制磷酸化酪氨酸磷酸酶（PTPS）的活性，從而啟動(dòng)下游氧化還原反應(yīng)，調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷移，凋亡和血管生成過(guò)程。 本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)：在肝臟缺血再灌注損傷模型中，阻斷Notch信號(hào)通路可以引起體外肝臟缺血再灌注損傷；肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高。提示我們：Notch信號(hào)是否參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS的生成？Notch信號(hào)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS的生成的分子機(jī)制是什么？Notch信號(hào)調(diào)控ROS生成對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為的影響？Notch信號(hào)調(diào)控ROS生成對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為影響的分子機(jī)制是什么？這些問題的闡明將為血管生成相關(guān)性研究開辟新的領(lǐng)域并進(jìn)一步完善血管生成分子調(diào)控的理論體系，為血管相關(guān)性疾病的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。 【方法】 1．對(duì)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法改良，建立人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）體外培養(yǎng)方法，獲得大量穩(wěn)定高效的原代血管內(nèi)皮細(xì)胞。利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)APC-CD31細(xì)胞Marker以及免疫組織化學(xué)進(jìn)行Ⅷ因子染色鑒定血管內(nèi)皮細(xì)胞的純度、MTT法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)曲線并在細(xì)胞外基質(zhì)膠上鑒定內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)。 2.體外原代培養(yǎng)的HUVECs，分為對(duì)照組和Notch信號(hào)阻斷組，利用DCFH-DA熒光探針結(jié)合用流式細(xì)胞技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。分別在生理狀態(tài)下以及缺血再灌注條件下細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，并使用相關(guān)的抑制劑作用血管內(nèi)皮細(xì)胞確定生理狀況下，ROS的主要來(lái)源。 3.體外培養(yǎng)人原代HUVECs被分為六組：對(duì)照組（DMSO組），單純Notch阻斷組（GSI組），Notch阻斷加NADPH氧化酶阻斷組（GSI+DPI），Notch阻斷加抗氧化劑組（GSI+NAC），單純NADPH氧化酶阻斷組(DPI)和單純抗氧化劑組(NAC)。刺激后分別用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖；劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移；結(jié)晶紫染色檢測(cè)細(xì)胞黏附；細(xì)胞外基質(zhì)膠（Matrigel）檢測(cè)管腔形成。 4.體外原代培養(yǎng)的HUVECs，分為照組和Notch信號(hào)阻斷組，經(jīng)刺激48h，RIPA裂解收取蛋白，定量并變性后，蛋白印記法（Western-Blots）檢測(cè)HUVECs相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化。 【結(jié)果】 1．采用改良體外培養(yǎng)HUVECs培養(yǎng)方法，獲得大量穩(wěn)定血管內(nèi)皮細(xì)胞，應(yīng)用含5%胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基（ECM）培養(yǎng)細(xì)胞，MTT法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)曲線表明：細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛2-3d生長(zhǎng)最快，4-6d可融合。利用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行APC-CD31細(xì)胞Marker以及免疫組織化學(xué)進(jìn)行Ⅷ因子染色鑒定，血管內(nèi)皮細(xì)胞的純度高達(dá)99.56%。 2.體外原代培養(yǎng)的HUVECs，經(jīng)GSI阻斷Notch信號(hào)后，利用DCFH-DA熒光探針結(jié)合用流式細(xì)胞技術(shù)，結(jié)果表明：在生理狀態(tài)下以及缺血再灌注條件下細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平明顯升高。隨后使用相關(guān)的抑制劑作用血管內(nèi)皮細(xì)胞后，利用DCFH-DA熒光探針結(jié)合用流式細(xì)胞技術(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：生理狀況下，ROS的主要來(lái)源于細(xì)胞膜上的NADPH氧化酶。 3.體外培養(yǎng)的HUVECs，各組經(jīng)刺激后分別用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖、劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移、檢測(cè)黏附及體外管腔形成。結(jié)果顯示：阻斷Notch信號(hào)通路后，HUVECs增殖明顯增加；細(xì)胞遷移速度加快；黏附以及管腔生成增加；利用ROS清除劑以及NOX抑制劑后，細(xì)胞增殖明顯減慢；劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移；細(xì)胞遷移，黏附及管腔形成實(shí)驗(yàn)均得到相似結(jié)果。 4.體外原代培養(yǎng)的HUVECs經(jīng)GSI阻斷Notch信號(hào)48h后，蛋白印記法（Western-Blots）檢測(cè)HUVECs相關(guān)蛋白結(jié)果顯示：阻斷Notch后，NOX4蛋白含量明顯增加；VEGFR2，P38及ERK的磷酸化水平增加；SOD1蛋白水平未見明顯變化。 【結(jié)論】 1．采用改良外培養(yǎng)HUVECs培養(yǎng)方法，獲得大量穩(wěn)定高純度的HUVECs，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供充足的細(xì)胞來(lái)源。 2.體外培養(yǎng)HUVECs，經(jīng)GSI阻斷Notch信號(hào)后，在生理狀態(tài)下以及缺血再灌注條件下細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平明顯升高；使用相關(guān)的抑制劑后，證實(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來(lái)源來(lái)細(xì)胞膜上的NADPH氧化酶。 3.體外培養(yǎng)HUVECs，經(jīng)GSI阻斷Notch信號(hào)及各組經(jīng)刺激后， HUVECs細(xì)胞增殖、遷移、黏附及管腔生成明顯增加；利用ROS清除劑以及NOX抑制劑后，細(xì)胞增殖明顯減慢；劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移；細(xì)胞遷移，黏附及管腔形成實(shí)驗(yàn)均得到相似結(jié)果，說(shuō)明Notch信號(hào)時(shí)通過(guò)調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平來(lái)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為。 4.體外原代培養(yǎng)的HUVECs經(jīng)GSI阻斷Notch信號(hào)48h后，Western-Blots結(jié)果顯示：HUVECs經(jīng)GSI阻斷Notch信號(hào)后，ROS水平增加是NOX4蛋白激活引起其產(chǎn)生增多而非SOD1對(duì)其清除減少引起的；增加的ROS通過(guò)引起下游VEGFR2，P38及ERK的磷酸化水平增加而引起下游一系列信號(hào)反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：Notch信號(hào)途徑 ROS 血管內(nèi)皮細(xì)胞 血管生成
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-15
• 前言15-17
• 文獻(xiàn)回顧17-25
• 第一部分：血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定25-33
• 1 材料25-26
• 2 方法26-27
• 3 結(jié)果27-31
• 4 討論31-33
• 第二部分：NOTCH 信號(hào)調(diào)控 ROS 生成對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及分子機(jī)制研究33-46
• 1 材料33-35
• 2 方法35-38
• 3 結(jié)果38-43
• 4 討論43-46
• 小結(jié)46-48
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果54-56
• 致謝56

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 梁潔;韓驊;;Notch信號(hào)通路與血管發(fā)育[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2008年12期

  本文關(guān)鍵詞：Notch信號(hào)調(diào)控ROS產(chǎn)生對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：364877