發(fā)布時間：2017-05-14 10:10

  本文關(guān)鍵詞：Notch信號調(diào)控ROS產(chǎn)生對血管內(nèi)皮細胞生物學(xué)行為的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【研究背景】 血管生成是一個涉及內(nèi)皮細胞（ECS）、平滑肌細胞（SMC）協(xié)同作用的多步驟多環(huán)節(jié)的過程。在VEGF等促血管生成因子的刺激下，，血管內(nèi)皮細胞從原有的血管萌出，不斷增殖，遷移，分化以形成新的血管，隨后募集周細胞包被新生血管，促進其成熟。Notch信號通路在血管生成中具有重要的作用，可通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的增殖，遷移或者分化以及平滑肌細胞的募集進而調(diào)控血管生成。如以γ-分泌酶抑制劑（GSI）阻斷Notch信號通路或者在血管內(nèi)皮細胞上敲除Notch的配體DLL4或者Notch1均可導(dǎo)致血管生成中tip細胞數(shù)量增加。另外，Notch信號途徑也被報道在維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的作用。然而，Notch信號如何調(diào)控新生血管形成的分子機制，尚未完全清楚。 目前，大量文獻報道，活性氧簇（Reactive oxygen species, ROS）主要包括過氧化氫和超氧陰離子等活性氧分子，它在細胞的生理和病理狀態(tài)下均發(fā)揮重要作用。低濃度的ROS可作為信號分子，介導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖和遷移，并調(diào)節(jié)體內(nèi)血管生成。NADPH氧化酶家族（NOX）是由多個亞基組成的酶復(fù)合體，其主要包括:位于胞膜的細胞色素b558（gp91phox和p22phox）和位于胞漿的p67phox、p47phox、及Rac（小GTP結(jié)合蛋白）等五個亞基。p22phox和gp91phox是NOX的酶促核心成員，它們受Rac及p47phox的調(diào)節(jié)。近年來在對各種組織的研究中發(fā)現(xiàn)：NOX共有5種同源家族體，分別稱為NOX1、NOX2、NOX3、NOX4和NOX5，其分別表達在不同組織中，血管內(nèi)皮細胞主要表達NOX2和NOX4。許多刺激因素，如血管內(nèi)皮生長因子，缺氧和缺血再灌注（I/R），可通過激活內(nèi)皮細胞NADPH氧化酶的活性，增加細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，產(chǎn)生的ROS可通過抑制磷酸化酪氨酸磷酸酶（PTPS）的活性，從而啟動下游氧化還原反應(yīng)，調(diào)控內(nèi)皮細胞增殖，遷移，凋亡和血管生成過程。 本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)：在肝臟缺血再灌注損傷模型中，阻斷Notch信號通路可以引起體外肝臟缺血再灌注損傷；肝細胞內(nèi)ROS水平明顯升高。提示我們：Notch信號是否參與調(diào)控血管內(nèi)皮細胞ROS的生成？Notch信號調(diào)控血管內(nèi)皮細胞ROS的生成的分子機制是什么？Notch信號調(diào)控ROS生成對血管內(nèi)皮細胞生物學(xué)行為的影響？Notch信號調(diào)控ROS生成對血管內(nèi)皮細胞生物學(xué)行為影響的分子機制是什么？這些問題的闡明將為血管生成相關(guān)性研究開辟新的領(lǐng)域并進一步完善血管生成分子調(diào)控的理論體系，為血管相關(guān)性疾病的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。 【方法】 1．對傳統(tǒng)培養(yǎng)方法改良，建立人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVECs）體外培養(yǎng)方法，獲得大量穩(wěn)定高效的原代血管內(nèi)皮細胞。利用流式細胞技術(shù)檢測APC-CD31細胞Marker以及免疫組織化學(xué)進行Ⅷ因子染色鑒定血管內(nèi)皮細胞的純度、MTT法觀察細胞生長曲線并在細胞外基質(zhì)膠上鑒定內(nèi)皮細胞管腔形成實驗。 2.體外原代培養(yǎng)的HUVECs，分為對照組和Notch信號阻斷組，利用DCFH-DA熒光探針結(jié)合用流式細胞技術(shù)，檢測細胞內(nèi)ROS水平。分別在生理狀態(tài)下以及缺血再灌注條件下細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，并使用相關(guān)的抑制劑作用血管內(nèi)皮細胞確定生理狀況下，ROS的主要來源。 3.體外培養(yǎng)人原代HUVECs被分為六組：對照組（DMSO組），單純Notch阻斷組（GSI組），Notch阻斷加NADPH氧化酶阻斷組（GSI+DPI），Notch阻斷加抗氧化劑組（GSI+NAC），單純NADPH氧化酶阻斷組(DPI)和單純抗氧化劑組(NAC)。刺激后分別用MTT法檢測細胞增殖；劃痕法檢測細胞遷移；結(jié)晶紫染色檢測細胞黏附；細胞外基質(zhì)膠（Matrigel）檢測管腔形成。 4.體外原代培養(yǎng)的HUVECs，分為照組和Notch信號阻斷組，經(jīng)刺激48h，RIPA裂解收取蛋白，定量并變性后，蛋白印記法（Western-Blots）檢測HUVECs相關(guān)蛋白表達水平變化。 【結(jié)果】 1．采用改良體外培養(yǎng)HUVECs培養(yǎng)方法，獲得大量穩(wěn)定血管內(nèi)皮細胞，應(yīng)用含5%胎牛血清的內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基（ECM）培養(yǎng)細胞，MTT法觀察細胞生長曲線表明：細胞生長旺盛2-3d生長最快，4-6d可融合。利用流式細胞技術(shù)進行APC-CD31細胞Marker以及免疫組織化學(xué)進行Ⅷ因子染色鑒定，血管內(nèi)皮細胞的純度高達99.56%。 2.體外原代培養(yǎng)的HUVECs，經(jīng)GSI阻斷Notch信號后，利用DCFH-DA熒光探針結(jié)合用流式細胞技術(shù)，結(jié)果表明：在生理狀態(tài)下以及缺血再灌注條件下細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平明顯升高。隨后使用相關(guān)的抑制劑作用血管內(nèi)皮細胞后，利用DCFH-DA熒光探針結(jié)合用流式細胞技術(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：生理狀況下，ROS的主要來源于細胞膜上的NADPH氧化酶。 3.體外培養(yǎng)的HUVECs，各組經(jīng)刺激后分別用MTT法檢測細胞增殖、劃痕法檢測細胞遷移、檢測黏附及體外管腔形成。結(jié)果顯示：阻斷Notch信號通路后，HUVECs增殖明顯增加；細胞遷移速度加快；黏附以及管腔生成增加；利用ROS清除劑以及NOX抑制劑后，細胞增殖明顯減慢；劃痕法檢測細胞遷移；細胞遷移，黏附及管腔形成實驗均得到相似結(jié)果。 4.體外原代培養(yǎng)的HUVECs經(jīng)GSI阻斷Notch信號48h后，蛋白印記法（Western-Blots）檢測HUVECs相關(guān)蛋白結(jié)果顯示：阻斷Notch后，NOX4蛋白含量明顯增加；VEGFR2，P38及ERK的磷酸化水平增加；SOD1蛋白水平未見明顯變化。 【結(jié)論】 1．采用改良外培養(yǎng)HUVECs培養(yǎng)方法，獲得大量穩(wěn)定高純度的HUVECs，為后續(xù)實驗提供充足的細胞來源。 2.體外培養(yǎng)HUVECs，經(jīng)GSI阻斷Notch信號后，在生理狀態(tài)下以及缺血再灌注條件下細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平明顯升高；使用相關(guān)的抑制劑后，證實血管內(nèi)皮細胞內(nèi)ROS的主要來源來細胞膜上的NADPH氧化酶。 3.體外培養(yǎng)HUVECs，經(jīng)GSI阻斷Notch信號及各組經(jīng)刺激后， HUVECs細胞增殖、遷移、黏附及管腔生成明顯增加；利用ROS清除劑以及NOX抑制劑后，細胞增殖明顯減慢；劃痕法檢測細胞遷移；細胞遷移，黏附及管腔形成實驗均得到相似結(jié)果，說明Notch信號時通過調(diào)細胞內(nèi)ROS的水平來影響血管內(nèi)皮細胞生物學(xué)行為。 4.體外原代培養(yǎng)的HUVECs經(jīng)GSI阻斷Notch信號48h后，Western-Blots結(jié)果顯示：HUVECs經(jīng)GSI阻斷Notch信號后，ROS水平增加是NOX4蛋白激活引起其產(chǎn)生增多而非SOD1對其清除減少引起的；增加的ROS通過引起下游VEGFR2，P38及ERK的磷酸化水平增加而引起下游一系列信號反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：Notch信號途徑 ROS 血管內(nèi)皮細胞 血管生成
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R3411
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-15
• 前言15-17
• 文獻回顧17-25
• 第一部分：血管內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)及鑒定25-33
• 1 材料25-26
• 2 方法26-27
• 3 結(jié)果27-31
• 4 討論31-33
• 第二部分：NOTCH 信號調(diào)控 ROS 生成對血管內(nèi)皮細胞生物學(xué)行為的影響及分子機制研究33-46
• 1 材料33-35
• 2 方法35-38
• 3 結(jié)果38-43
• 4 討論43-46
• 小結(jié)46-48
• 參考文獻48-54
• 個人簡歷和研究成果54-56
• 致謝56

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 梁潔;韓驊;;Notch信號通路與血管發(fā)育[J];細胞與分子免疫學(xué)雜志;2008年12期

  本文關(guān)鍵詞：Notch信號調(diào)控ROS產(chǎn)生對血管內(nèi)皮細胞生物學(xué)行為的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：364877