TLRs是天然免疫應(yīng)答中一類高度保守的模式識(shí)別受體。通過(guò)識(shí)別病原體相關(guān)的分子模式，TLRs活化后促進(jìn)免疫細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素，從而清除病原微生物的感染。Rab5a是Rabs家族的一個(gè)主要成員，定位于質(zhì)膜、早期內(nèi)體和網(wǎng)格蛋白覆蓋的囊泡。它負(fù)責(zé)調(diào)控早期內(nèi)體與胞吞泡融合，是早期胞吞途徑的一個(gè)主要限速成分。有研究發(fā)現(xiàn)，Rab5a不但參與了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸和蛋白分選，還參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Rab5a如何調(diào)控TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)尚未見(jiàn)報(bào)道。目的：研究Rab5a在巨噬細(xì)胞RAW264.7中對(duì)TLR3和TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用。方法：通過(guò)脂質(zhì)體法將Rab5a及其突變體Rab5aN133I的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中，G418選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)Rab5a和Rab5aN133I的細(xì)胞系。通過(guò)RT PCR和Realtime PCR和Western Blot方法鑒定穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。MTT法分析其生長(zhǎng)特性，LPS和polyI:C刺激巨噬細(xì)胞系不同時(shí)間，檢測(cè)iNOS、TNF α和IL6的表達(dá)水平的變化。結(jié)果：轉(zhuǎn)染Rab5a/Rab5aN133I細(xì)胞Rab5a mRNA水平顯著高... 

【文章來(lái)源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁(yè)數(shù)】：46 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

TLR3介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)圖

Rab5a 調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中 TLR3/TLR4 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究單核巨噬細(xì)胞表面的 CD14， CD14 可以富集 LPS 促使 TLR4 活化，細(xì)傳遞致使轉(zhuǎn)錄因子NF κB和AP 1等的活化，效應(yīng)細(xì)胞合成表達(dá)更多的TNIL 6 和 IL 8[36]，炎癥因子的增高引起了一系列病理生理變化。最近幾年發(fā)硬化（artherosclerosis, AS）[37]的發(fā)生和發(fā)展與炎癥和免疫反應(yīng)息息相t[38]等通過(guò)研究動(dòng)脈粥樣硬化斑，發(fā)現(xiàn) TLR4 的表達(dá)顯著提高，并且證實(shí) 相互識(shí)別導(dǎo)致一系列與 AS 相關(guān)的細(xì)胞因子的合成與釋放。研究發(fā)現(xiàn)一些或抑制 TLR4 的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。例如：IL 1 通過(guò)下調(diào) TLR4 的表達(dá)誘導(dǎo)小刺激產(chǎn)生低反應(yīng)性。Dagvadorj[39]等的研究表明，IL 10 可減少 MyD88 的抑制 LPS 誘導(dǎo)的 TNF α 的轉(zhuǎn)錄。Bafica 等[40]的研究發(fā)現(xiàn)，一些內(nèi)源性因饋調(diào)節(jié) TLR4 信號(hào)通路。如：LPS 誘導(dǎo)產(chǎn)生的 IFN 促進(jìn)了一種鳥(niǎo)苷三磷7/Irgml 的轉(zhuǎn)錄，LRG47/Irgml 可以負(fù)向調(diào)控 TLR4 信號(hào)通路，抑制炎性細(xì)度產(chǎn)生。一些負(fù)反饋調(diào)節(jié)信號(hào)蛋白在對(duì) LPS 耐受的形成過(guò)程的調(diào)控作用控制 G 細(xì)菌的感染。(圖 2)。

細(xì)胞計(jì)數(shù)后將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系以 5×105/孔接種于 6 孔板，設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁12h 后即可更換成不含胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基。LPS/Poly I:C 刺激 0h、12h 和 24h，取上清，按照 ELISA 測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定上清中細(xì)胞因子的含量，酶標(biāo)儀 450nm測(cè)定吸光值。以 OD 值為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)即為樣品的實(shí)際濃度。3 結(jié)果分析3.1 穩(wěn)定表達(dá) Rab5a 細(xì)胞系的鑒定篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系后，為了排除假陽(yáng)性的可能，我們通過(guò)半定量的 RT PCR鑒定細(xì)胞系是否成功的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，如下圖 3a 所示，轉(zhuǎn)染 Rab5a 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒細(xì)胞和Rab5a 突變過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的 Rab5a 表達(dá)量明顯大于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。接著我們?cè)俅斡?Real time PCR 驗(yàn)證也得到了同樣的結(jié)果（圖 3b）。以上結(jié)果說(shuō)明穩(wěn)定表達(dá)Rab5a 的細(xì)胞系已經(jīng)成功建立。a b

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Toll樣受體3介導(dǎo)抑制Bewo細(xì)胞中乙型肝炎病毒復(fù)制[J]. 資捷,王前,鄭磊,熊石龍,王芳.  中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志. 2011(10)
[2]Rab蛋白在囊泡運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)中的作用[J]. 趙縝,樊綺詩(shī).  生命的化學(xué). 2009(05)
[3]Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)在關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用[J]. 奚正德,胡峻熊.  國(guó)際內(nèi)科學(xué)雜志. 2009(06)
[4]Toll樣受體4介導(dǎo)的革蘭陰性細(xì)菌免疫應(yīng)答研究進(jìn)展[J]. 劉會(huì)領(lǐng),陳敏,陳昌輝.  實(shí)用兒科臨床雜志. 2008(10)
[5]Toll樣受體4的研究及現(xiàn)狀[J]. 趙保勝,霍海如,姜廷良.  中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué). 2007(01)
[6]聚肌胞對(duì)小鼠前列腺癌的抑制作用[J]. 田原僮,潘玉琢,趙燕穎,范文靜,趙麗娟,趙雪儉.  吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2006(05)
[7]Toll樣受體4與動(dòng)脈粥樣硬化[J]. 王虹艷,曲鵬.  心血管病學(xué)進(jìn)展. 2005(S1)
[8]rab5a基因在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用研究[J]. 史忠誠(chéng),于旸,李鈺,傅松濱.  遺傳. 2005(05)
[9]IFN-γ對(duì)體外培養(yǎng)系統(tǒng)中IL-18誘導(dǎo)的腫瘤快速殺傷效應(yīng)的影響[J]. 方艷秋,宋燕,張慧杰,譚巖,劉立華,段秀梅,姜艷芳.  吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2003(04)
[10]RAB5A蛋白的研究進(jìn)展[J]. 宋春嬌,史忠誠(chéng).  國(guó)外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊(cè). 2003(03)



本文編號(hào)：3527264