本文關(guān)鍵詞：基于肝損傷小鼠模型重構(gòu)小鼠和人的肝臟，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目前,肝病相關(guān)的體內(nèi)研究多基于在小鼠的肝臟開(kāi)展。然而,小鼠肝臟與人的存在差異,致使基于小鼠肝臟獲得的許多研究結(jié)果不能直接應(yīng)用到人體,而人的體內(nèi)研究受倫理和技術(shù)等方面的制約。肝臟人源化的嵌合體(人鼠嵌合肝)小鼠是在人肝臟發(fā)育和再生機(jī)制、人類肝臟相關(guān)疾病(肝炎、肝硬化和肝癌等)發(fā)病機(jī)制、肝炎病毒(HBV和HCV等)易感動(dòng)物模型建立、藥物代謝動(dòng)力學(xué)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值,其也為在大動(dòng)物(如小型豬)體內(nèi)重構(gòu)人肝臟提供理論依據(jù)和進(jìn)行實(shí)踐探索,并成為臨床前研究由鼠到人之間的重要載體和橋梁。因此,制備高比率嵌合有人肝細(xì)胞的人-鼠嵌合肝對(duì)人類的肝病研究具有巨大而深遠(yuǎn)的意義。 早期是將人肝細(xì)胞異位移植進(jìn)小鼠體內(nèi)建立人鼠嵌合肝,現(xiàn)在隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步,人們開(kāi)始將目光轉(zhuǎn)向利用干細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)人和鼠肝臟的嵌合。干細(xì)胞(stem cells, SC)是一類具有自我復(fù)制能力(self-renewing)的多潛能細(xì)胞,它是一種未充分分化,尚不成熟的細(xì)胞,具有再生各種組織器官和人體的潛在功能,醫(yī)學(xué)界稱為“萬(wàn)用細(xì)胞”。這就為干細(xì)胞在一定環(huán)境下發(fā)育成肝細(xì)胞提供了理論依據(jù)。同時(shí)也為在小鼠體內(nèi)建立人鼠嵌合肝模型提供了可能。 截止到現(xiàn)在,國(guó)內(nèi)外均有文獻(xiàn)報(bào)道將干細(xì)胞通過(guò)核移植或?qū)m內(nèi)移植進(jìn)正常動(dòng)物體內(nèi),以實(shí)現(xiàn)多組織多器官的嵌合。但是,由于宿主體內(nèi)的微環(huán)境中缺乏移植細(xì)胞生長(zhǎng)的各種激素和生長(zhǎng)因子,宿主細(xì)胞的增殖將優(yōu)先于移植細(xì)胞,因此,各組織器官的嵌合率比較低。為了克服上述困難,得到高比率嵌合的個(gè)體,選用特定器官缺陷的動(dòng)物模型作為受體環(huán)境是較為理想的選擇。 富馬酰乙酰乙酸鹽水解酶(Fah)基因敲除小鼠缺乏Fah基因,酪氨酸分解代謝的最后一步受到阻礙,導(dǎo)致富馬酰乙酰乙酸鹽(FAA)和前體(MAA)底物的聚集,FAA與MAA對(duì)肝臟有毒性。利用此肝損傷小鼠模型作為受體動(dòng)物,將人干細(xì)胞移植進(jìn)該鼠的囊胚中,有望提高人干細(xì)胞在宿主體內(nèi)的增殖優(yōu)勢(shì),這對(duì)研發(fā)人肝細(xì)胞高比率嵌合的嵌合肝模型是至關(guān)重要的。 為實(shí)現(xiàn)靈敏的非損傷、實(shí)時(shí)和可視化體內(nèi)示蹤移植供體細(xì)胞及其在體內(nèi)衍生的細(xì)胞,通過(guò)綜合分析活體內(nèi)生物發(fā)光[用熒光素酶(Luciferase, Luc)基因標(biāo)記細(xì)胞等]成像和熒光[熒光報(bào)告基團(tuán)(GFP和RFP等)]成像各自的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì),為將生物發(fā)光成像和熒光成像的優(yōu)點(diǎn)集為一身,我們將用雙報(bào)告或三熒光報(bào)告基因標(biāo)記供體移植細(xì)胞,已達(dá)到活體示蹤的目的。 在研究中,我們首先利用小鼠誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(Mouse induced pluripotent stem cells, miPSCs)通過(guò)囊胚腔移植(Blastocyst transplantation)建立鼠/鼠嵌合肝動(dòng)物模型,待方法和技術(shù)成熟后再利用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Human bone marrow mesenchymal stem cells, hMSCs)通過(guò)囊胚腔移植建立人/小鼠嵌合肝動(dòng)物模型。 第一部分小鼠誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(miPSCs)囊胚腔移植建立鼠/鼠嵌合肝動(dòng)物模型 目的： 通過(guò)小鼠誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(miPSCs)囊胚腔移植建立鼠/鼠嵌合肝動(dòng)物模型,一方面可以觀察干細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)受損肝臟的修復(fù)作用,另一方面為建立人/鼠嵌合肝模型提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。 材料和方法： (1)慢病毒載體pEF1a-ZsGreen-Fluc鑒定,慢病毒生產(chǎn)與鑒定,慢病毒感染miPSCs;(2)檢測(cè)病毒感染后的miPSCs(LG-miPSCs)是否仍然保持其干性；(3)鼠/鼠嵌合體動(dòng)物的制作將攜帶有綠色熒光蛋白(ZsGreen)和熒光素酶(Flue)雙報(bào)告基因的miPSCs移植進(jìn)Fah(-/-)小鼠的囊胚中,然后將囊胚移植進(jìn)假孕母鼠的子宮內(nèi),待其出生；(4)體式熒光顯微鏡檢測(cè)待小鼠出生后3天在鏡下觀察是否可以看到綠色熒光,待小鼠成年后取材,取其肝臟、腎臟、心臟、腦、肺臟、脾臟等臟器在鏡下觀察是否可見(jiàn)綠色熒光；(5)小動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)小鼠從出生到成年,不同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射Flue底物,觀察是否可見(jiàn)Fluc熒光；(6)PCR檢測(cè)取成年后小鼠的肝臟、鼠尾、肺、腦、腎臟、心臟、脾臟、腸等組織,一部分用于提取基因組DNA[另一部分用于制備石蠟切片以用于HE染色和免疫熒光(Immunofluorescence)檢測(cè)],并采用Fah引物PCR檢測(cè)各器官中是否有移植細(xì)胞的嵌合；(7)HE染色觀察嵌合體動(dòng)物肝臟的組織結(jié)構(gòu)以確定肝臟結(jié)構(gòu)是否正常；(8)免疫熒光檢測(cè)檢測(cè)嵌合體小鼠肝臟中Fah基因的表達(dá)水平,及其白蛋白(Alb)、CK18、CK19、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)的表達(dá)；(9) Western blot檢測(cè)嵌合體小鼠肝臟中Fah基因表達(dá)。 結(jié)果： (1)慢病毒載體鑒定、感染miPSCs以及其干性的鑒定鑒定結(jié)果符合預(yù)期,感染miPSCs(LG-miPSCs)效率接近100%,LG-miPSCs仍保持其多向分化潛能； (2)妊娠結(jié)局先后將LG-miPSCs移植進(jìn)160枚Fah(-/-)小鼠的囊胚中,接著種植到10只假孕母鼠的子宮內(nèi),有四窩仔鼠順利出生,數(shù)量共38只,經(jīng)過(guò)撤藥處理后,最終有2只幸存鼠發(fā)育到成年； (3)體視熒光顯微鏡和小動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)從出生到取材各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)到ZsGreen和Flue雙報(bào)告基因的表達(dá)； (4)Fah或Luc基因的基因型鑒定采用PCR對(duì)潛在的嵌合鼠所取肝臟組織針對(duì)FAH或Luc基因行基因型鑒定,在嵌合肝中檢測(cè)到野生型Fah基因和報(bào)告基因Flue的存在； (5)HE染色嵌合鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)與正常小鼠的結(jié)構(gòu)基本一致,而撤藥的和沒(méi)撤藥的Fah(-/-)小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂無(wú)序； (6)免疫熒光檢測(cè)嵌合體小鼠肝臟免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,大部分肝細(xì)胞表達(dá)Fah,兩只嵌合體小鼠的嵌合肝中LG-miPSCs衍生的鼠肝細(xì)胞的嵌合率分別為84.69%和88.43%,同時(shí)Fah陽(yáng)性的肝細(xì)胞(即LG-miPSCs衍生的鼠肝細(xì)胞)能夠正常表達(dá)Alb、CK18、CK19和transferrin; (7) Western blot檢測(cè)Fah基因表達(dá)兩只嵌合體小鼠的嵌合肝均能正常表達(dá)Fah基因,而Fah(-/-)小鼠未檢測(cè)到Fah基因表達(dá)。 結(jié)論： (1)成功獲得LG-miPSCs衍生的鼠肝細(xì)胞高比率嵌合的鼠-鼠嵌合肝小鼠模型,這為進(jìn)一步利用hMSCs通過(guò)囊胚腔移植建立人/小鼠嵌合肝動(dòng)物模型奠定了良好基礎(chǔ)。 第二部分人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)囊胚腔移植建立人/鼠嵌合肝動(dòng)物模型的前期工作 目的： 通過(guò)人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(hMSCs)囊胚腔移植在小鼠受損肝臟上建立人／鼠嵌合肝動(dòng)物模型,該模型一方面將為在生物活體內(nèi)研究人干細(xì)胞生物學(xué)行為提供理想模型,另一方面也將為在體內(nèi)研究人類肝臟發(fā)育和再生、肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展和治療以及藥物代謝評(píng)價(jià)提供理想模型。 材料和方法： (1)慢病毒載體pCMV-RFP-Alb-fLuc-ZsGreen(簡(jiǎn)稱為pCRAGL)鑒定,慢病毒生產(chǎn)與鑒定,慢病毒感染hMSCs; (2)病毒感染后hMSCs干性的鑒定； 結(jié)果： (1)慢病毒載體鑒定、感染hMSCs以及其干性的鑒定鑒定結(jié)果符合預(yù)期,感染hMSCs效率為95%以上,感染后hMSCs(簡(jiǎn)稱為RLG-hMSCs)仍保持其多向分化潛能；
【關(guān)鍵詞】：誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞 小鼠 囊胚腔移植 胚胎微環(huán)境 鼠/鼠嵌合肝模型 人/鼠嵌合肝模型 人源化動(dòng)物 干細(xì)胞 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞 人源化器官 人源化肝臟/嵌合肝臟 小動(dòng)物活體成像儀 綠色熒光蛋白 紅色熒光蛋白 螢火蟲熒光素酶
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R-332;R575
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-13
• 前言13-20
• 第一部分 小鼠誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(miPSCs)囊胚腔移植建立鼠/鼠嵌合肝動(dòng)物模型20-44
• 第一章 攜帶Fluc和ZsGreen雙報(bào)告基因miPSCs系的建立及其鑒定20-26
• 1. 材料和方法20-24
• 2. 結(jié)果24-26
• 3. 討論26
• 第二章 LG-miPSCs移植進(jìn)Fah(-/-)小鼠囊胚中制備鼠/鼠嵌合肝模型26-44
• 1. 材料和方法26-40
• 2. 結(jié)果40-42
• 3. 討論42-44
• 第二部分 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)囊胚腔移植建立人/鼠嵌合肝動(dòng)物模型44-51
• 第一章 攜帶RFP-Fluc-ZsGreen三報(bào)告基因hMSCs細(xì)胞系的建立及其鑒定46-51
• 1. 材料和方法46-49
• 2. 結(jié)果49-50
• 3. 討論50-51
• 第三部分 全文討論51-54
• 參考文獻(xiàn)54-57
• 附圖57-66
• 縮略表66-67
• 致謝67-68

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1 李學(xué)強(qiáng);耿東升;劉發(fā);;佳加鈣口服液對(duì)鉛中毒的防治作用[J];實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué);2007年01期

2 楊明華;楊蘇蓓;柴可夫;金祖漢;陳婉姬;;四氧嘧啶致小鼠糖尿病造模條件優(yōu)化及穩(wěn)定性考察[J];中藥藥理與臨床;2007年05期

3 范紅斌;李英;包菊平;邱麗穎;程建青;楊志勇;杜斌;;冰醋酸致小鼠實(shí)驗(yàn)性腹膜炎模型的研究[J];中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志;2007年06期

4 郭偉;李孟榮;肖建軍;黃敏;;塵螨過(guò)敏性哮喘小鼠模型的建立與評(píng)估[J];中國(guó)當(dāng)代兒科雜志;2008年05期

5 杜曉棠;陳雪松;張美娟;季e鹲

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