本文關(guān)鍵詞：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)分化及向裸鼠移植的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)具有向多種成熟細(xì)胞分化的潛能，如成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及成脂肪細(xì)胞等，其分離、培養(yǎng)較為容易，純度高，且來源豐富，可在體外多次擴增，異體移植免疫排斥風(fēng)險小。由于UC-MSCs具有以上的優(yōu)點，使其逐漸被研究者所關(guān)注，尤其是在組織的修復(fù)方面，可以將其應(yīng)用于器官、組織的修復(fù)及重建。本實驗通過研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離，在不同條件下的培養(yǎng)及鑒定，得出培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的最優(yōu)培養(yǎng)條件。并進一步通過間接共培養(yǎng)的誘導(dǎo)方式使其向汗腺細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化，將誘導(dǎo)后的UC-MSCs用BrdU進行標(biāo)定，移植入裸鼠皮膚，觀察其在裸鼠體內(nèi)的存活及分布狀況。 方法： 1UC-MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定：獲得無菌足月剖宮產(chǎn)健康胎兒臍帶，剪刀將其剪成3-4cm長短的臍帶組織段，，生理鹽水反復(fù)沖洗，去除殘留的血液，剪刀將其剪開后鑷子剔除臍帶中的兩條臍動脈、一條臍靜脈，以免被血管內(nèi)皮細(xì)胞所污染。用鑷子將臍帶中的沃頓膠組織(Wharton’sJelly)呈條索狀撕裂下來，剪刀剪成大小約1mm3的沃頓膠組織塊，置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長滿瓶底后，0.25%胰酶消化貼壁細(xì)胞，進行傳代。流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)細(xì)胞的表面抗原表達情況。 2UC-MSCs生長的影響因素及生長曲線的繪制：用MTT比色法分別檢測不同胎牛血清濃度在490nm處吸光度值的均數(shù)(OD值)。同樣用MTT比色法分別檢測當(dāng)種植密度不同時在490nm處吸光度值的均數(shù)(OD值)。觀察傳代后不同時期UC-MSCs的生長情況，繪制生長曲線。 3汗腺細(xì)胞(h-SGCs)培養(yǎng)：將所取正常全層皮膚，去除皮下脂肪后，剪成1mm3大小組織塊，用Ⅱ型膠原酶消化法獲得汗腺組織，培養(yǎng)汗腺細(xì)胞(h-SGCs)貼壁生長；大部分汗腺團塊貼壁后，進行換液，此后3-4天換液一次。對培養(yǎng)細(xì)胞進行免疫組化檢測CEA和CK7表面抗原的表達情況。 4UC-MSCs誘導(dǎo)分化及鑒定：將培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞進行47℃水浴造成體外熱休克，通過傳三代(p3)UC-MSCs間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)UC-MSCs分化為有汗腺表型的干細(xì)胞，免疫組化法檢測CEA和CK7表面抗原的表達情況。 5對誘導(dǎo)后干細(xì)胞進行核型分析：將誘導(dǎo)后細(xì)胞加入秋水仙素0.2mg/L一滴，低滲固定消化等處理，進行細(xì)胞染色體檢測。 6BrdU轉(zhuǎn)染及鑒定：在傳3代(p3)UC-MSCs中加入BrdU抗原40μg/ml用來標(biāo)記培養(yǎng)基，48h后，可見UC-MSCs生長良好，懸浮細(xì)胞少，鋪片用免疫組化法檢測轉(zhuǎn)染情況。 7將誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞進行裸鼠移植：將誘導(dǎo)分化后的UC-MSCs進行BrdU標(biāo)定，與人脫細(xì)胞異體真皮共同覆蓋在裸鼠缺損皮膚創(chuàng)面上，覆蓋異體裸鼠皮片，打包固定。2周后將包與縫線拆除，1個月后取活檢，進行HE及免疫組化檢測。移植后連續(xù)觀察實驗鼠3個月。 結(jié)果： 1UC-MSCs分離、培養(yǎng)、鑒定：培養(yǎng)3-5d后,已有少量臍帶組織塊周圍爬出成纖維樣細(xì)胞。一周后，可見部分組織塊周圍爬出成纖維樣細(xì)胞，給予換液。之后2-3天給予換液一次，傳1、2代(p1、P2)的UC-MSCs呈長梭行，形態(tài)均一。培養(yǎng)至傳八代細(xì)胞(P8)，UC-MSCs仍然存活，但生長緩慢，形態(tài)開始發(fā)生變化，折光性變得較差，部分細(xì)胞已開始脫壁凋亡。對分離培養(yǎng)的UC-MSCs進行流式細(xì)胞術(shù)檢測，干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD105表達率較高，造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD45幾乎不表達，提示本實驗培養(yǎng)得到的細(xì)胞為較純化的MSCs。 2UC-MSCs生長的影響因素及生長曲線的繪制：當(dāng)胎牛血清濃度為10%時MTT比色法檢測OD490值最高，細(xì)胞活性好，活細(xì)胞數(shù)量較多。當(dāng)種植密度為105/ml時MTT比色法檢測OD490值最高，細(xì)胞活性好，活細(xì)胞數(shù)量較多。繪制的細(xì)胞生長曲線包括滯留期、生長對數(shù)期、平臺期。 3汗腺細(xì)胞(h-SGCs)培養(yǎng)：培養(yǎng)3天后，已有汗腺貼壁，鏡下可見汗腺團塊周圍爬出不規(guī)則形細(xì)胞，呈集落狀生長；培養(yǎng)7天后，大部分汗腺團塊貼壁，給予換液；12天后，鏡下可見汗腺團塊周圍爬滿不規(guī)則細(xì)胞，呈鋪路石樣生長。 4UC-MSCs誘導(dǎo)分化及鑒定：將誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞進行免疫組化檢測細(xì)胞特異抗原，CEA和CK7包漿染色均為紅棕色，為陽性。 5對誘導(dǎo)后干細(xì)胞進行核型分析：鏡下隨機觀察30個細(xì)胞的染色體，計數(shù)染色體條數(shù)，結(jié)果染色體數(shù)均為46條，均未見染色體變異。 6BrdU轉(zhuǎn)染及鑒定：免疫組化檢測結(jié)果可見部分細(xì)胞核呈棕黃色。 7將誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞進行裸鼠移植：HE染色可見脫細(xì)胞異體真皮中細(xì)胞均勻分布。免疫組化檢測BrdU抗原表達情況，可見BrdU標(biāo)定的誘導(dǎo)后干細(xì)胞均勻分布在人脫細(xì)胞異體真皮中。 結(jié)論： 本實驗通過研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離，在不同條件下的培養(yǎng)、誘導(dǎo)及鑒定，得出培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的最優(yōu)培養(yǎng)條件。并進一步通過間接共培養(yǎng)的誘導(dǎo)方式使其向汗腺細(xì)胞分化，將誘導(dǎo)后的UC-MSCs用BrdU進行標(biāo)定，移植入裸鼠皮膚，觀察其在裸鼠體內(nèi)的存活及分布狀況，得到以下結(jié)論： 1流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD105表達率較高，造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD14、CD34、CD45幾乎不表達，提示本實驗培養(yǎng)得到的細(xì)胞較純，可以用于實驗研究。 2實驗中我們發(fā)現(xiàn)最適宜UC-MSCs生長的環(huán)境為含10%胎牛血清和90%DMEM(L)的培養(yǎng)液，最適宜UC-MSCs生長的種植密度為105/ml。UC-MSCs生長呈現(xiàn)先慢后快再慢的S型曲線，實驗中我們可以發(fā)現(xiàn)P3以內(nèi)的UC-MSCs形態(tài)穩(wěn)定、適應(yīng)性強、代謝旺盛，可用于后續(xù)實驗研究。 3經(jīng)鑒定，誘導(dǎo)后干細(xì)胞免疫組化檢測CEA和CK7表面抗原均為陽性，提示誘導(dǎo)后干細(xì)胞已具備汗腺細(xì)胞表型。 4染色體檢測結(jié)果顯示，此間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)方式對染色體核型無明顯變化，為安全、可靠誘導(dǎo)方式。 5經(jīng)檢測，BrdU轉(zhuǎn)染為成功的。 6動物實驗證實：誘導(dǎo)分化后的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植在裸鼠缺損皮膚上安全、有效。移植后連續(xù)觀察實驗鼠3個月，未發(fā)現(xiàn)有不良反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs) 汗腺細(xì)胞(h-SGCs) 誘導(dǎo)分化 間接共培養(yǎng) 染色體
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-21
• 結(jié)果21-23
• 附圖23-32
• 附表32-33
• 討論33-36
• 結(jié)論36
• 參考文獻36-39
• 綜述 干細(xì)胞實現(xiàn)汗腺再生的研究現(xiàn)狀39-48
• 參考文獻44-48
• 致謝48-49
• 個人簡歷49

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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  本文關(guān)鍵詞：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)分化及向裸鼠移植的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：352162