目的：（1）利用流式細胞儀檢測表皮細胞整合素β1亞基（CD29）和增殖細胞核抗原（PCNA）的熒光標記強度，建立簡便易行的表皮干細胞檢測方法。（2）利用該檢測手段，通過優(yōu)化表皮細胞分離、培養(yǎng)條件，以提高培養(yǎng)表皮細胞中的干細胞數(shù)量。（3）構建人整合素β1基因重組腺病毒載體，轉染表皮細胞，觀察其生物學特征的改變，為進一步皮膚組織工程研究提供理論基礎和研究手段。方法：（1）分離表皮細胞，通過粘附選擇富集表皮干細胞和短暫擴充細胞，觀察細胞克隆形成率，流式細胞儀檢測表皮細胞CD29和PCNA、熒光免疫組織化學檢測BrdU的熒光標記強度，分析上述指標間的相關性。（2）利用L16（4⁴）正交表設計試驗，選擇原代培養(yǎng)消化過程中Dispase Ⅱ酶與胰蛋白酶不同濃度和作用時間，以及無血清培養(yǎng)基中EGF、胰島素、霍亂毒素、氫化考的松的不同濃度為實驗因素，考察表皮細胞生物學性狀和其中CD29⁺／PCNA^-細胞的比例，優(yōu)化最佳分離和培養(yǎng)條件。（3）利用AdeasyTM系統(tǒng)構建含ITG-β1基因片段的重組腺病毒載體，轉染人原代培養(yǎng)表皮細胞，觀察細... 

【文章來源】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學上海市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：90 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

不同粘附選擇時間富集細胞形成克隆的大小A粘附選擇10min，B粘附選擇10h

2.2表皮干細胞檢測指標的比較粘附選擇10min所獲得的干細胞為主的表皮細胞中CD29沖CNA一的比例約為67%(見圖)，而已TA為主的細胞中僅有1429%，熒光染色見圖2;而BrdU在這兩群細胞中的陽性率分別為58.57%和9.84%(見表2、圖3);細胞周期分析顯示GO/GI、S的比例在兩群細胞中也有顯著的差異(見表3、圖4)。經(jīng)相關分析，CD29+PCNA一與Brd了及細胞周期分析間具有良好的相關性(r值分別為0.94和0.87)。表2富集的不同表皮細胞CD29+PCNA一細胞比例的變化CD29+PCNA一細胞比例粘附選擇時間—即刻培養(yǎng)7天粘附10min67.33士13.5614.29士4.25粘附10h41.92士11.329.61士2.87

粘附選擇10min所獲得的干細胞為主的表皮細胞中CD29沖CNA一的比例約為67%(見圖)，而已TA為主的細胞中僅有1429%，熒光染色見圖2;而BrdU在這兩群細胞中的陽性率分別為58.57%和9.84%(見表2、圖3);細胞周期分析顯示GO/GI、S的比例在兩群細胞中也有顯著的差異(見表3、圖4)。經(jīng)相關分析，CD29+PCNA一與Brd了及細胞周期分析間具有良好的相關性(r值分別為0.94和0.87)。表2富集的不同表皮細胞CD29+PCNA一細胞比例的變化CD29+PCNA一細胞比例粘附選擇時間—即刻培養(yǎng)7天粘附10min67.33士13.5614.29士4.25粘附10h41.92士11.329.61士2.87

【參考文獻】：
期刊論文
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[2]表皮細胞生長因子治療創(chuàng)面出現(xiàn)的干細胞島現(xiàn)象[J]. 付小兵,孫曉慶,孫同柱,董永洪,顧小曼,陳偉,盛志勇.  中華醫(yī)學雜志. 2001(12)
[3]Dispase Ⅱ和胰酶消化法分離大鼠皮膚角朊細胞的對比研究[J]. 崔正軍,陳璧,湯朝武,姜篤銀.  第四軍醫(yī)大學學報. 1998(03)
[4]混合培養(yǎng)自體與異體表皮細胞的移植方法[J]. 蘇波,俞為榮,朱世輝,唐洪泰,夏照帆,葛繩德.  第二軍醫(yī)大學學報. 1997(01)
[5]增殖細胞核抗原的研究進展[J]. 黃杰雄.  國外醫(yī)學(生理、病理科學與臨床分冊). 1994(01)



本文編號：3494634