本文關鍵詞：調節(jié)Matriptase-2表達，活化以及胞外段脫落（酶切）的分子學機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶（Type Ⅱ Transmembrane Serine Protease，TTSPs）是一類通過氨基末端跨膜區(qū)域錨定在細胞膜上的蛋白酶，在哺乳動物的許多病理、生理過程中扮演著重要的角色，其功能異�？蓪е掳┌Y、缺鐵性貧血、耳聾、心血管疾病等。在人類，TTSPs共有17個成員，其中對matriptase-2的研究比較少，目前對其生物學功能的了解，主要是它可以通過調控hepcidin的表達來調節(jié)體內鐵穩(wěn)態(tài)；除此之外，有研究表明它在乳腺癌和睪丸癌的發(fā)生發(fā)展過程中也起到一定的作用，但在這些疾病的發(fā)生發(fā)展中，matriptase-2的具體生物學功能并不明確。目前已知，matriptase-2的活化和胞外段脫落是其發(fā)揮自身功能的前提條件，但是對于調節(jié)matriptase-2表達，活化和胞外段脫落（酶切）的分子機制仍不清楚。本研究旨在探究調節(jié)matriptase-2的表達，活化以及胞外段脫落（酶切）的分子學機制。 方法： （1）利用RT-PCR，PCR從人肝臟組織中提取出matriptase-2基因，然后連接到帶有V5標簽的真核表達質粒中； （2）matriptase-2重組質粒轉染HEK293和肝癌細胞，然后利用細胞免疫熒光技術檢驗matriptase-2在這些細胞中能否成功表達； （3）免疫共沉淀收集條件培養(yǎng)基中的可溶性matriptase-2片段； （4）用生物素標記和免疫共沉淀分離、提取膜蛋白； （5）利用蛋白酶抑制劑，免疫共沉淀以及western blot探究哪類蛋白酶抑制劑能抑制matriptase-2胞外段脫落； （6）利用點突變阻斷對matriptase-2活性至關重要的兩個位點，用來探究matriptase-2能否自身活化；同樣地，利用點突變分別阻斷matriptase-2上的七個糖基化修飾位點，用來研究各個糖基化位點對matriptase-2的表達，活化和胞外段脫落（酶切）的影響； （7）Western blot分析matriptase-2在細胞裂解液，上清以及膜蛋白中的表達，活化以及胞外段脫落情況； 結果： （1）利用RT-PCR和PCR成功從人肝組織中提取到matriptase-2cDNA，連接到帶有V5標簽的質粒后，經(jīng)測序所有的堿基序列與人matriptase-2基因序列保持一致。 （2）重組matriptase-2質粒轉染到人胚腎細胞HEK293和肝癌細胞BEL7402后，利用細胞免疫熒光檢測到錨定于細胞膜上的matriptase-2，，這表明我們所建立的細胞模式很成功，能夠用于以后的實驗。 （3）用Western blot和免疫共沉淀分析matriptase-2在HEK293和肝癌細胞（BEL-7402、SMMC-7721、QGY-7703）中的活化情況。結果表明matriptase-2在HEK293細胞中的活化和胞外段脫落（酶切）情況與在肝癌細胞中是一致的；其中~30kDa條帶為matriptase-2的活化條帶。 （4）利用免疫共沉淀和western blot，檢測在條件培養(yǎng)基中加入各種蛋白酶抑制劑（GM6001、ALLM、benzamidine(benz)、TAPI-1）后，上清中是否存在可溶性Matriptase-2片段。結果顯示，在加入絲氨酸蛋白酶抑制劑（benzamidine）后，條件培養(yǎng)基（opti-MEM，沒有血清的培養(yǎng)基）中的可溶性matriptase-2均顯著減少；而加入其它蛋白酶抑制劑后，條件培養(yǎng)基中的matriptase-2保持不變。 （5）利用點突變得到致使matriptase-2失去活性的R576A和S762A（R576—活化酶切位點被突變掉；S762A—催化區(qū)中對自身活性至關重要的一個位點被突變掉）。然后，通過western blot檢測這兩個突變體的條件培養(yǎng)基中是否存在可溶性matriptase-2片段。結果顯示，兩個突變體的條件培養(yǎng)基（opti-MEM，沒有血清的培養(yǎng)基）中均沒有可溶性matriptase-2片段。 （6）利用生物素標記提取膜蛋白，然后western blot分析matriptase-2在細胞膜上的活化情況。結果顯示，在表達野生型matriptase-2的HEK293和BEL7402的膜蛋白中，檢測到~30kDa的條帶；在表達matriptase-2的兩個突變體（R576A、S762A）的膜蛋白中，沒有檢測到~30kDa的條帶。~30kDa條帶為matriptase-2的活化條帶。 （7）利用western blot分析matriptase-2的糖基化修飾類型。結果顯示，在加入PNGase F的細胞裂解液中，matriptase-2的分子量下降；加入O-glycanase的細胞裂解液中，matriptase-2的分子量沒有變化；而在加入PNGase F+O-glycanase的細胞裂解液中，matriptase-2的分子量亦下降，鑒于糖基化修飾分為N-糖基化修飾和O-糖基化修飾，故而我們得出matriptase-2的糖基化修飾主要是N-糖基化修飾。 （8）利用點突變分別阻斷matriptase-2的七個糖基化修飾位點，得到N136Q、N184Q、N216Q、N338Q、N433Q、N453Q、N518Q七個突變體，然后通過免疫共沉淀和western blot分析這七個糖基化修飾位點對其表達，活化和胞外段脫落（酶切）的影響。結果表明這些糖基化修飾位點并不影響matriptase-2表達以及在細胞膜上的錨定。然而，N216Q、N453Q和N518Q卻能明顯抑制matriptase-2的活化，進而阻止了matriptase-2從細胞膜上的脫落（酶切），而其他5個突變體并沒有影響到matriptase-2的活化和酶切。 結論：我們比較系統(tǒng)全面地研究了matriptase-2在HEK293和肝癌細胞中的活化和酶切情況，我們發(fā)現(xiàn)matriptase-2在胞漿中無法被活化，但是錨定在膜上后可以通過自我酶切使自身活化，并且活化的matriptase-2可以酶切自身進而與胞膜脫落。我們也發(fā)現(xiàn)了N-糖基化修飾對matriptase-2的活化和胞外段脫落（酶切）具有重要的影響但并不影響其表達以及到膜上的錨定�？傊�，我們的結果為研究調節(jié)matriptase-2的表達，活化，胞外段脫落（酶切）的分子機制提供了新的見解。
【關鍵詞】：Matriptase-2 Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶 糖基化修飾
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 一、引言13-16
• 二、材料與方法16-27
• 2.1 實驗材料16-19
• 2.1.1 細胞系16
• 2.1.2 只要試劑和材料16-18
• 2.1.3 主要儀器和設備18
• 2.1.4 常用緩沖液及配制18-19
• 2.2 實驗方法19-27
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)19
• 2.2.2 RNA 提取19-20
• 2.2.3 RT-PCR 和 PCR20-22
• 2.2.4 回收純化目的基因22-23
• 2.2.5 目的基因與載體（質粒）連接23
• 2.2.6 瞬時轉染實驗23-24
• 2.2.7 細胞免疫熒光實驗24
• 2.2.8 免疫共沉淀24-25
• 2.2.9 蛋白質免疫印跡實驗（Western blot）25-26
• 2.2.10 膜蛋白分離提取實驗26-27
• 三、結果27-37
• 3.1 重組蛋白（MT2-V5）在 HEK 293 和 BEL 7402 細胞膜上定位情況27-28
• 3.2 Matriptase-2 在細胞裂解液和上清中的活化、酶切情況28-30
• 3.3 蛋白酶抑制劑對 Matriptase-2 胞外段脫落（酶切）的影響30-31
• 3.4 Matriptase-2 的自切31-32
• 3.5 Matriptase-2 在細胞膜上的活化情況32-34
• 3.6 糖基化修飾對 Matriptase-2 表達，活化以及胞外段脫落（酶切）的影響34-37
• 四、討論37-40
• 五、展望40-41
• 參考文獻41-45
• 綜述：Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶的研究進展45-56
• 參考文獻50-56
• 碩士學位期間發(fā)表的論文56-57
• 縮略詞表57-59
• 致謝59-61

【共引文獻】

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  本文關鍵詞：調節(jié)Matriptase-2表達，活化以及胞外段脫落（酶切）的分子學機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：347773