目的1．建立體外分析抗原特異性T細(xì)胞的檢測(cè)方法--四聚體染色技術(shù)，為深入探討表位特異性CTL的生物學(xué)功能以及更全面理解HBV特異CTL在HBV感染中的致病機(jī)理奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；2．應(yīng)用四聚體染色技術(shù)和流式染色分析抗原特異性CTL在自限性和慢性HBV感染中頻率和生物學(xué)功能；3．分析HBV慢性感染者抗原特異性CTL細(xì)胞功能耗竭可能機(jī)制，為慢性感染免疫調(diào)節(jié)治療提供可能途徑和新的治療靶點(diǎn)。方法1．應(yīng)用基因工程技術(shù)原核高效表達(dá)HLA-A^*0201-BSP、HLA-A^*2402-BSP、HLA-A^*1101-BSP和β2m蛋白后，分別與常見(jiàn)的HBV抗原肽在體外復(fù)性折疊成可溶性的抗原肽復(fù)合物單體；經(jīng)BirA酶作用并通過(guò)凝膠過(guò)濾層析法純化復(fù)合物單體；分別將復(fù)合物單體與藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素按一定比例（5：1）耦合構(gòu)建成四聚體。2．Dot blotting方法檢測(cè)HLA-A^*0201-β2m-抗原肽、HLA-A^*2402-p2m-抗原肽、HLA-A^*1101-β2m-抗原肽復(fù)... 

【文章來(lái)源】：華中科技大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

HLA一A*0201、HLA一A*2402、HLA一A*1101復(fù)合物生物素化

華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文在層析過(guò)程中出現(xiàn)3個(gè)洗脫峰，如圖1一3所示，第I峰為重鏈多聚體，第H峰為可溶性的復(fù)合物單體，第111峰為叩m及一些小分子物質(zhì)[36]。將第11峰的樣本收集超濾濃縮，并與層析前的樣本進(jìn)行非變性隊(duì)GE分析，結(jié)果顯示7種生物素化后的樣品經(jīng)層析后均得到較純的復(fù)合物單體(見(jiàn)圖1一4)。HLA‘A’0201·HBV一Pol575書(shū) 63HLA·A，0201一BV一eore，8一70.8

W6/32是抗人HLAI類(lèi)分子的單克隆抗體(mAb)，只能識(shí)別輕鏈和重鏈結(jié)合形成的復(fù)合物，不與單獨(dú)的輕鏈結(jié)合，和重鏈僅有極微弱的結(jié)合。Dot一Blotting的結(jié)果表明(圖1一5):只有7種生物素化的復(fù)合物單體能夠和該構(gòu)象抗體特異性結(jié)合，輕鏈和重鏈都沒(méi)有結(jié)合。用w6/32和兔抗人叩m抗體進(jìn)行的雙抗夾心ELISA結(jié)果(圖1一6)顯示7種復(fù)合物單體在 A450/A630nm和空白對(duì)照相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，這些都表明這7種復(fù)合物單體具有正確的空間構(gòu)象。圖1一5復(fù)合物單體構(gòu)象Dot一Blotting檢測(cè)l生物素化HLA一A*0201一HBV-pol575一583復(fù)合物;2生物素化HLA一 A*0201一HBV-corels一27復(fù)合物;3生物素化HLA一A*0201一HBV-env335一343復(fù)合物;4生物素化HLA一A*2402一HBV-pol756一764復(fù)合物:5生物素化HLA一A*2402一HBV-eorell7一125復(fù)合物;6生物素化HLA一 A*1101一HBV-presllo一17復(fù)合物:7生物素化HLA一 A*1101一HBV-eore88一96復(fù)合物;8重鏈;9輕鏈:0價(jià)9哎︸O蔑的圖1一6生物素化復(fù)合物單

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]A comparative review of HLA associations with hepatitis Band C viral infections across global populations[J]. Rashmi Singh,Rashmi Kaul,Anil Kaul,Khalid Khan.  World Journal of Gastroenterology. 2007(12)
[2]HLA多態(tài)性在廣東漢族人群分布的特殊性[J]. 肖露露,陳洪濤,葉欣,馬琳雅,譚茵,張升.  中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志. 1999(04)



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