指數(shù)式富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的研究核酸結(jié)構(gòu)、功能及進(jìn)化的一種新的組合化學(xué)技術(shù)。它在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床診斷及藥物篩選方面具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究的目的是建立并完善隨機(jī)RNA文庫(kù)技術(shù)，并篩選牛凝血酶和噬菌體末端酶大亞基gp16特異結(jié)合的抑制性RNA配基，為新型藥物篩選及抗病毒研究提供理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究利用基因工程方法在大腸桿菌表達(dá)并純化了T7RNA聚合酶，該酶具有很好的體外轉(zhuǎn)錄活性。1mg純化的T7RNA聚合酶相當(dāng)于250U Promega產(chǎn)品。我們采用全長(zhǎng)68nt，隨機(jī)區(qū)由25個(gè)堿基構(gòu)成的RNA文庫(kù)，篩選獲得了與牛凝血酶特異結(jié)合的配基。配基高度富集為2條序列，它們與牛凝血酶的親和力較高，解離常數(shù)分別為164nmol／L和240nmol／L。RNA配基能夠體外抑制牛凝血酶的催化酶切活性，是作用在牛凝血酶的肝素結(jié)合位點(diǎn)上。對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析表明，隨機(jī)區(qū)形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。針對(duì)配基的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)并篩選到能夠迅速逆轉(zhuǎn)RNA配基生物活性的反義寡核苷酸拮抗劑。在以上研究工作基礎(chǔ)上，又篩選了在噬菌體Φ29的基因組DNA組裝過(guò)程中起重要作用的末... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：93 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

IAT7RNA聚合酶表達(dá)定圖

TT測(cè)定:錄酶為陽(yáng)性對(duì)照，設(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn)判定我們表表1.1體外轉(zhuǎn)錄樣品成分123ll4(Promega)64(Promega)62(Promega)644(自配)6466

6一8:與人凝血酶、牛纖維蛋白原、胃蛋白酶結(jié)合情況由放射自顯影圖可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)7輪篩選后的RNA只與牛凝血酶結(jié)合，而不與人酶、牛纖維蛋白原及胃蛋白酶等無(wú)關(guān)蛋白結(jié)合。并且RNA配基與牛凝血酶的呈劑量效應(yīng)關(guān)系，即隨著牛凝血酶的量的增加與其結(jié)合的RNA也增加。RNA配基的克隆、測(cè)序第7輪篩選出的RNA配基，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成DNA，回收純化后連接到T載體中，克隆。隨機(jī)挑取23個(gè)克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，21個(gè)克隆的序列是一致的;2個(gè)克隆序列是相同的。分別將它們命名為T705RNA和T7lORNA。RNA:AUGGUACGGUACUUCCUUUGGAAGAUAGCUGGAGAACUAACCAAAACACGCUACUUUGCUAARNA:AUGGUACGGUACUUCCAAGUGCGGGGGGGAGGUGGUGGUUCCAAAACACGCUACUUUGCUAA線部分為隨機(jī)區(qū)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]隨機(jī)RNA文庫(kù)的構(gòu)建[J]. 楊光,邵寧生,柳川.  軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊. 2000(03)



本文編號(hào)：3411865