neuB1基因失活空腸彎曲菌突變株的構(gòu)建及其臨床意義
發(fā)布時間：2021-09-17 21:43
目的構(gòu)建唾液酸合成酶基因1（neuB1）失活、脂多糖（LPS）中唾液酸（SA）缺失的空腸彎曲菌（Campylobacterjejuni,Cj）O∶19突變株,以確認CjLPS中,含SA基團的終端GM1樣結(jié)構(gòu)在Cj相關(guān)格林-巴利綜合征（GBS）發(fā)病機理中的關(guān)鍵作用。方法從已有neuB1基因失活的Cj腸炎相關(guān)菌株O∶2DNA中,將含卡那霉素抗性基因（KmRcassette）的neuB1突變片段———neuB1::KmR克隆到pGEM-T載體,形成突變載體pGEM-neuB1::KmR,進一步轉(zhuǎn)化到與GBS相關(guān)的CjO∶19野生株,獲得CjO∶19突變株,行PCR和RT-PCR鑒定。SDS-PAGE分析CjLPS,過碘酸-間苯二酚和酸性茚三酮反應法分別檢測CjLPS中SA�；魜y毒素B亞單位（CTB）結(jié)合反應檢測Cj菌體裂解物及LPS中神經(jīng)節(jié)苷脂GM1模擬結(jié)構(gòu)。最后以突變株及其同源野生株LPS為抗原分別免疫豚鼠,第5周取坐骨神經(jīng)原纖維分離。結(jié)果neuB1基因突變片段———neuB1::KmR成功克隆到pGEM-T載體中,進而構(gòu)建得neuB1基因失活的Cj突變株。后者LPS已喪失SA基團且不能與...
【文章來源】：中華微生物學和免疫學雜志. 2005,(07)北大核心
【文章頁數(shù)】：6 頁
【部分圖文】：
突變載體pGEM-neuB1::KmR的鑒定
列長度相符,表明突變載體與CjO∶19野生株染色體DNA之間發(fā)生同源重組,KmRcassette成功插入neuB1基因中(圖2)。突變株P(guān)CR產(chǎn)物測序更進一步證實同源重組成功,且顯示KmRcassette轉(zhuǎn)錄方向與neuB1基因相同,不會影響neuB1下游基因的活性。(2)RT-PCR鑒定:提取細菌RNA,進行neuB1基因的RT-PCR擴增,突變株RT-PCR擴增產(chǎn)物為陰性而野生株陽性(圖2),表明野生株具有neuB1基因的轉(zhuǎn)錄活性,而突變株的neuB1基因由于KmRcas-sette的插入而失活。(3)突變菌株的穩(wěn)定性鑒定:野生株和突變株分別連續(xù)培養(yǎng)25代后,其DNA的PCR和RNA的RT-PCR結(jié)果與(1)和(2)相同
*:P<0.05, compared with distilled water6·Cj菌體裂解物及LPS與CTB結(jié)合反應:結(jié)果(圖4)顯示,Cj野生株菌體裂解物和LPS均能與CTB發(fā)生顯著結(jié)合反應,表明Cj野生株中存在與GM1寡糖基團模擬的結(jié)構(gòu)。突變株菌體裂解物和LPS卻皆不能與CTB結(jié)合,證實突變株中已不存在GM1樣模擬結(jié)構(gòu)。圖4 Cj菌體裂解物和LPS與CTB的結(jié)合反應Fig 4. Assay of CTB binding toCjlysates and LPSWildCjLPS/lysate(1) could bind to CTB butthemutantLPS/lysate(2)could not, indicating that there was no GM1-like epitope in the mutant strain7·CjLPS免疫全身后豚鼠坐骨神經(jīng)原纖維分離:見圖5。各組分別檢測1000根神經(jīng)原纖維(10只豚鼠),野生株LPS免疫組原纖維異常率達17.3%(173/1000),其中65.0%為軸索變性。其異常原纖維發(fā)生率明顯高于PBS對照組(1.6%, 16/1000
【參考文獻】：
期刊論文
[1]neuB1失活空腸彎曲菌突變株滅活全菌苗經(jīng)鼻免疫小鼠的實驗研究[J]. 向淑利,蔡方成,鄧兵,張曉萍. 現(xiàn)代預防醫(yī)學. 2010(16)
[2]neuB1失活空腸彎曲菌O∶19突變株感染致病力的初步研究[J]. 向淑利,蔡方成,張曉萍. 第三軍醫(yī)大學學報. 2007(23)
[3]滅活全菌neuB1失活空腸彎曲菌突變株口服免疫BALB/c小鼠的實驗研究[J]. 向淑利,蔡方成,張曉萍,鄧兵. 中國人獸共患病學報. 2007(01)
[4]吉蘭-巴雷綜合征的研究進展[J]. 蔡方成,鐘敏. 實用兒科臨床雜志. 2006(12)
碩士論文
[1]青島地區(qū)雞源空腸彎曲菌流行病學、ERIC-PCR分型及毒力基因研究[D]. 翟海華.山東農(nóng)業(yè)大學 2014
[2]吉蘭—巴雷綜合征相關(guān)空腸彎曲菌cstⅡ基因序列對比研究[D]. 孫世超.河北醫(yī)科大學 2011
[3]空腸彎曲菌galE及Cj1136、Cj1138、Cj1139基因序列對比研究[D]. 李鑫.河北醫(yī)科大學 2010
[4]電針五臟俞對EAN家兔協(xié)同刺激分子CD80、CD86mRNA蛋白反應水平影響的研究[D]. 賀蘭蘭.長春中醫(yī)藥大學 2009
[5]格林—巴利綜合征的流行性及其危險因素[D]. 邱仁娜.吉林大學 2008
本文編號：3399547
【文章來源】：中華微生物學和免疫學雜志. 2005,(07)北大核心
【文章頁數(shù)】：6 頁
【部分圖文】：
突變載體pGEM-neuB1::KmR的鑒定
列長度相符,表明突變載體與CjO∶19野生株染色體DNA之間發(fā)生同源重組,KmRcassette成功插入neuB1基因中(圖2)。突變株P(guān)CR產(chǎn)物測序更進一步證實同源重組成功,且顯示KmRcassette轉(zhuǎn)錄方向與neuB1基因相同,不會影響neuB1下游基因的活性。(2)RT-PCR鑒定:提取細菌RNA,進行neuB1基因的RT-PCR擴增,突變株RT-PCR擴增產(chǎn)物為陰性而野生株陽性(圖2),表明野生株具有neuB1基因的轉(zhuǎn)錄活性,而突變株的neuB1基因由于KmRcas-sette的插入而失活。(3)突變菌株的穩(wěn)定性鑒定:野生株和突變株分別連續(xù)培養(yǎng)25代后,其DNA的PCR和RNA的RT-PCR結(jié)果與(1)和(2)相同
*:P<0.05, compared with distilled water6·Cj菌體裂解物及LPS與CTB結(jié)合反應:結(jié)果(圖4)顯示,Cj野生株菌體裂解物和LPS均能與CTB發(fā)生顯著結(jié)合反應,表明Cj野生株中存在與GM1寡糖基團模擬的結(jié)構(gòu)。突變株菌體裂解物和LPS卻皆不能與CTB結(jié)合,證實突變株中已不存在GM1樣模擬結(jié)構(gòu)。圖4 Cj菌體裂解物和LPS與CTB的結(jié)合反應Fig 4. Assay of CTB binding toCjlysates and LPSWildCjLPS/lysate(1) could bind to CTB butthemutantLPS/lysate(2)could not, indicating that there was no GM1-like epitope in the mutant strain7·CjLPS免疫全身后豚鼠坐骨神經(jīng)原纖維分離:見圖5。各組分別檢測1000根神經(jīng)原纖維(10只豚鼠),野生株LPS免疫組原纖維異常率達17.3%(173/1000),其中65.0%為軸索變性。其異常原纖維發(fā)生率明顯高于PBS對照組(1.6%, 16/1000
【參考文獻】：
期刊論文
[1]neuB1失活空腸彎曲菌突變株滅活全菌苗經(jīng)鼻免疫小鼠的實驗研究[J]. 向淑利,蔡方成,鄧兵,張曉萍. 現(xiàn)代預防醫(yī)學. 2010(16)
[2]neuB1失活空腸彎曲菌O∶19突變株感染致病力的初步研究[J]. 向淑利,蔡方成,張曉萍. 第三軍醫(yī)大學學報. 2007(23)
[3]滅活全菌neuB1失活空腸彎曲菌突變株口服免疫BALB/c小鼠的實驗研究[J]. 向淑利,蔡方成,張曉萍,鄧兵. 中國人獸共患病學報. 2007(01)
[4]吉蘭-巴雷綜合征的研究進展[J]. 蔡方成,鐘敏. 實用兒科臨床雜志. 2006(12)
碩士論文
[1]青島地區(qū)雞源空腸彎曲菌流行病學、ERIC-PCR分型及毒力基因研究[D]. 翟海華.山東農(nóng)業(yè)大學 2014
[2]吉蘭—巴雷綜合征相關(guān)空腸彎曲菌cstⅡ基因序列對比研究[D]. 孫世超.河北醫(yī)科大學 2011
[3]空腸彎曲菌galE及Cj1136、Cj1138、Cj1139基因序列對比研究[D]. 李鑫.河北醫(yī)科大學 2010
[4]電針五臟俞對EAN家兔協(xié)同刺激分子CD80、CD86mRNA蛋白反應水平影響的研究[D]. 賀蘭蘭.長春中醫(yī)藥大學 2009
[5]格林—巴利綜合征的流行性及其危險因素[D]. 邱仁娜.吉林大學 2008
本文編號：3399547
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