紅血球的生成,是造血干細胞定向往紅細胞發(fā)育,成熟的過程,是一個連續(xù)而又具有階段性的過程。血型糖蛋白A的出現(xiàn)表示紅系終末分化的開始,細胞從原成紅細胞開始向嗜堿性幼紅細胞,嗜多色性幼紅細胞,正染色幼紅細胞增殖分化,最后細胞脫核后變成網(wǎng)織紅細胞。網(wǎng)織紅細胞經(jīng)過成熟變成成熟紅細胞后通過骨髓進入血液循環(huán)系統(tǒng)。本文建立了一個穩(wěn)定的模擬紅系體內(nèi)發(fā)育的培養(yǎng)體系,并運用蛋白質(zhì)印跡實驗和流式細胞學分析法檢測了數(shù)十種紅系發(fā)育相關(guān)的膜表面蛋白,骨架蛋白以及跨膜蛋白在培養(yǎng)過程中表達水平的變化。實驗結(jié)果表明,Band3在發(fā)育過程中上升的幅度最為明顯而α4integrin,一種粘附分子,先是保持高表達水平,而后降至最低。我們選取了Band3和a4integrin這兩個變化最大的膜蛋白作為標記物,搭配血型糖蛋白A,紅系的特異性標記物,對我們的培養(yǎng)體系的分化過程進行了監(jiān)測,并選取了第7天和第14天的細胞進行流式細胞分選。我們在第7天的細胞中得到了具有形態(tài)學特征的原成紅細胞,早期嗜堿性幼紅細胞,晚期嗜堿性幼紅細胞和嗜多色性幼紅細胞,我們在第十四天的細胞中得到了具有形態(tài)學特征的嗜多色性幼紅細胞和正染色幼紅細胞,流式細胞分選... 

【文章來源】：中南大學湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮寫詞簡表
前言
第一章 紅系發(fā)育培養(yǎng)系統(tǒng)的建立
    1.1 材料
        1.1.1 細胞培養(yǎng)試劑
        1.1.2 細胞來源
        1.1.3 CD34~+干細胞分離設(shè)施和試劑
        1.1.4 細胞離心涂片及Giemsa染色設(shè)備
        1.1.5 主要儀器
        1.1.6 緩沖液的配制
    1.2 方法
        1.2.1 CD34~+干細胞分離
        1.2.2 CD34~+細胞培養(yǎng)
        1.2.3 細胞離心涂片制備
        1.2.4 Giemsa染色
    1.3 結(jié)果
        1.3.1 細胞發(fā)育中的形態(tài)的觀察
        1.3.2 細胞在21天培養(yǎng)系統(tǒng)中的生長情況
    1.4 討論
第二章 紅細胞膜蛋白在發(fā)育中的變化
    2.1 材料
        2.1.1 抗體純化以及標記熒光試劑
        2.1.2 蛋白質(zhì)印跡所用抗體
        2.1.3 流式細胞學分析法所用抗體
        2.1.4 蛋白質(zhì)印跡相關(guān)設(shè)備
        2.1.5 流式細胞學分析法相關(guān)設(shè)備
    2.2 方法
        2.2.1 抗體的純化以及熒光標記
        2.2.2 蛋白質(zhì)印跡方法
        2.2.3 流式細胞學分析法
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 通過蛋白質(zhì)印跡法對膜蛋白和骨架蛋白的分析
        2.3.2 人紅系發(fā)育終末分化中膜表面蛋白的變化
    2.4 討論
第三章 用Band3和α4 integrin作為標記物來對體外培養(yǎng)中紅系終末分化的分析以及根據(jù)這兩個標記物將紅系終末發(fā)育的五個期的分選
    3.1 材料
        3.1.1 細胞培養(yǎng)
        3.1.2 流式細胞學分析
        3.1.3 流式細胞學分選的儀器和分析軟件
        3.1.4 流式分析以及流式分選所用的抗體
        3.1.5 細胞離心涂片以及Giemsa染色
    3.2 方法
        3.2.1 用雙標記物對培養(yǎng)的細胞進行分析
        3.2.2 熒光激活的流式細胞分選
        3.2.3 細胞離心涂片和Giemsa染色
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 用不同的組合對紅系終末分化發(fā)育的比較以及最終確定Band3和α4integrin為標記物
        3.3.2 流式細胞分選出在培養(yǎng)的CD34~+陽性的細胞中的不同期的細胞
    3.4 討論
第四章 體外培養(yǎng)細胞的有絲分裂能力和不同期細胞表面蛋白的表達水平
    4.1 材料
        4.1.1 流式分選過的細胞的培養(yǎng)材料
        4.1.2 洗脫抗體的材料
        4.1.3 流式細胞分選所用抗體
        4.1.4 抗體洗脫后再染色時用的抗體
    4.2 方法
        4.2.1 流式細胞學分選
        4.2.2 流式細胞分選后的不同期細胞的培養(yǎng)以及細胞計數(shù)
        4.2.3 抗體洗脫
        4.2.4 抗體洗脫后的細胞染色
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 紅系終末分化中不同期的有絲分裂能力
        4.3.2 洗脫流式細胞分選的細胞上的抗體以及重新染色對其進行流式細胞分析
    4.4 討論
第五章 正常人骨髓中紅系發(fā)育終末分化的研究以及人骨髓中幼稚細胞的流式細胞分選
    5.1 材料
        5.1.1 正常人骨髓的來源
        5.1.2 流式細胞分析所用的抗體
        5.1.3 流式細胞分選所用的抗體
        5.1.4 骨髓中CD45~+細胞消除的相關(guān)試劑以及設(shè)備
        5.1.5 細胞離心涂片以及Giemsa染色制備的設(shè)備
        5.1.6 流式細胞分析儀器和軟件
        5.1.7 流式細胞分選儀器和軟件
    5.2 方法
        5.2.1 正常人骨髓中單核細胞的分離
        5.2.2 骨髓中CD45~+細胞的消除
        5.2.3 骨髓細胞流式學分析
        5.2.4 骨髓流式細胞學分選
        5.2.5 細胞離心涂片和Giemsa染色
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 對于人骨髓的流式細胞學分析以及不同期細胞的劃分策略
        5.3.2 正常人骨髓的流式細胞分選以及細胞形態(tài)
        5.3.3 對人正常骨髓中紅系發(fā)育的各個期進行統(tǒng)計學分析
    5.4 討論
第六章 骨髓異常增生綜合癥病人紅系發(fā)育的異常發(fā)生
    6.1 材料
        6.1.1 骨髓異常增生綜合癥的病人骨髓來源
        6.1.2 流式細胞分析所用的抗體以及儀器設(shè)備
        6.1.3 骨髓中CD45~+細胞消除的相關(guān)試劑以及設(shè)備
    6.2 方法
        6.2.1 骨髓異常增生綜合癥的骨髓中單核細胞的分離方法
        6.2.2 骨髓異常增生綜合癥中單核細胞中CD45+細胞的消除法
        6.2.3 骨髗異常增生綜合癥中紅系細胞的流式細胞學染色
    6.3 結(jié)果
        6.3.1 骨髓異常增生綜合癥的病人的骨教中紅系發(fā)育異常
    6.4 討論
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學位期間主要研究成果
致謝



本文編號：3364341