本文關(guān)鍵詞：TRPC1在fMLP誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞定向移動中作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 人嗜中性粒細(xì)胞在血液中占白細(xì)胞總數(shù)的60%-70%,是機體先天免疫應(yīng)答的重要組成部分,處于機體抵御外來微生物病原體,特別是化膿性細(xì)菌入侵的第一道防線。定向移動是真核細(xì)胞的基本生物生理學(xué)特征,包括極性化和趨化兩部分。細(xì)胞極性(cell polarity)對正常細(xì)胞尤其是人嗜中性粒細(xì)胞的遷移,細(xì)胞質(zhì)分裂以及細(xì)胞分化等生物學(xué)過程起到關(guān)鍵性的作用。目前所說的細(xì)胞極性是指細(xì)胞為了行使某些特殊的生理功能或產(chǎn)生定向的分化,位于胞內(nèi)的信號分子產(chǎn)生不對稱分布致使細(xì)胞在形狀上產(chǎn)生不對稱性,具體表現(xiàn)為胞內(nèi)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等信號物質(zhì)不對稱分布,細(xì)胞骨架、胞內(nèi)其他物質(zhì)發(fā)生重構(gòu)。極性細(xì)胞外形特征是形成寬大的頭部即是偽足,狹窄的尾部稱為尾足。細(xì)胞趨化(Cell chemotaxis)是指細(xì)胞感受到內(nèi)外源趨化物質(zhì),并且能順著趨化物質(zhì)濃度梯度到達趨化物質(zhì)所在的部位,從而發(fā)揮生物生理學(xué)作用。所以,定向移動是中性粒細(xì)胞基本的功能。 中性粒細(xì)胞具有較強的定向遷移能力,一旦感知趨化物質(zhì)的存在,細(xì)胞便能迅速形成以頭部寬大,尾部狹窄為特征的極性形態(tài),到達趨化物質(zhì)存在的地方,發(fā)揮殺菌抗炎作用。盡管中性粒細(xì)胞生理功能如此重要,但中性粒細(xì)胞發(fā)揮定向遷移(趨化),殺菌抗炎作用的前提是依賴于極性的形成。定向遷移的基礎(chǔ)是細(xì)胞發(fā)生極性化,在極性化的基礎(chǔ)上進行趨化。但在中性粒細(xì)胞建立并維持極性形態(tài)的過程中,任何信號分子的調(diào)控失敗都會導(dǎo)致其生理功能異常。臨床上一些疾病如哮喘、敗血癥、缺血再灌注損傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過敏反應(yīng)及一些由于感染引起的器官衰竭反應(yīng)等都與中性粒細(xì)胞極性功能增強或減弱導(dǎo)致的定向移動異常密切相關(guān)。因此,研究調(diào)控中性粒細(xì)胞極性化和趨化性形成的分子機制,對防止和治療中性粒細(xì)胞功能異常導(dǎo)致的機體組織損傷具有重大的藥理和臨床意義。 近年來,研究細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣濃度(cytosolic free Ca2+concentration[Ca2+]i)和分布的變化參與中性粒細(xì)胞多種功能的調(diào)節(jié),如極性化趨化等已成為熱點。已有文獻報道人中性粒細(xì)胞由于缺乏電壓門控鈣通道(voltage-gated calcium channels, VGCC),細(xì)胞的外鈣內(nèi)流主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫清空引起質(zhì)膜上的鈣通道開放導(dǎo)致外鈣內(nèi)流,這就是所謂的鈣庫操縱鈣離子通道(store-operated Ca2+entry, SOCE)。目前除了STIM1和Orial蛋白是組成SOCE的兩種必需蛋白分子,大部分學(xué)者認(rèn)為SOCE另一個重要的候選分子是瞬時受體電位通道(transient receptor potential channel,TRP)中C家族成員TRPC1(TRP-canonical1)分子。TRP被認(rèn)為可能是鈣庫操縱性鈣通道的分子基礎(chǔ),原因可能是它與胞內(nèi)鈣離子濃度變化密切相關(guān)而且可能被其激活,TRPC是TRP家族的主要成員之一,在哺乳動物體內(nèi)有非常廣泛的表達,TRPC包括7個亞型,TRPC1-7,各亞型的分布與功能有所差別。其中TRPC1分布很廣,在骨骼肌、腎臟、腦、皮膚、肺、前列腺、心臟、睪丸和卵巢里都有高水平表達。在哺乳動物中最早被發(fā)現(xiàn)的TRP通道是TRPC1,其公認(rèn)的作用是鈣依賴的分泌、收縮和參與受體介導(dǎo)。TRPC1通常和包括PLC和IP3受體等蛋白組成信號復(fù)合物參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo),這種復(fù)合物的功能通過在胞膜的特定脂質(zhì)環(huán)境上組裝得到實現(xiàn)。作為SOCE重要的候選分子,TRPC1蛋白是細(xì)胞膜上非選擇性鈣通道,目前對TRPC1在極性化以及趨化過程中的作用研究很少,尤其是從膜電流角度去分析TRPC1的作用就更少。因此,利用膜片鉗技術(shù)從電生理學(xué)的角度去研究TRPC1在中性粒細(xì)胞極性化以及趨化過程中的作用,探討中性粒細(xì)胞極定向移動過程中TRPC1是否參與,在這個過程中起什么作用,如果TRPC1參與定向移動,那么如何調(diào)控細(xì)胞膜電流來達到定向移動的。目前對這方面的研究不多,本課題所開展的實驗就是為了回答這些問題,為研究中性粒細(xì)胞定向移動提供電生理學(xué)理論依據(jù)。 目前已經(jīng)證實中性粒細(xì)胞能夠被大量的趨化物包括內(nèi)源的趨化物激活,如白細(xì)胞介素8(interleukin8,IL-8)、血小板激活因子(pallet acticated factor, PAF)、補體成分C5a (complement component factor5a)和外源的趨化物質(zhì)激活,如甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine, fMLP)等。當(dāng)中性粒細(xì)胞感知到趨化物fMLP, fMLP刺激細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放鈣離子,細(xì)胞迅速朝趨化物濃度高的方向建立起一個頭寬尾窄的極性形態(tài),細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重構(gòu),促進極性的形成。細(xì)胞受到趨化物刺激形成極性,在這過程中細(xì)胞迅速啟動胞內(nèi)一系列復(fù)雜的極性信號機制,但是目前對這機制還不十分清楚,就極性過程中TRPC1如何調(diào)控極性細(xì)胞膜電流尚未見報道。本研究就是在外源趨化劑fMLP誘導(dǎo)人嗜中性粒細(xì)胞極性化的背景下去探討TRPC1是否參與定向移動,如何調(diào)控細(xì)胞膜電流,對極性化、趨化過程中膜電流的影響。 目的 本實驗通過使用均一、低濃度的外源趨化劑fMLP作用于人嗜中性粒細(xì)胞,建立細(xì)胞極性模型。應(yīng)用TRPC1蛋白抗體、阻斷劑(GsMTx-4)封閉和阻斷TRPC1蛋白通道,進而通過膜片鉗技術(shù)記錄中性粒細(xì)胞膜電容、各種處理因素TRPC1相關(guān)膜電流的變化,比較相應(yīng)的電流密度,以及通過Zigmond chamber觀察上述試劑對中性粒細(xì)胞極性趨化性的影響,利用Transwell小室觀察TRPC1抗體、阻斷劑(GsMTx-4)對嗜中性粒細(xì)胞遷移的影響,探討TRPC1是否參與中性粒細(xì)胞極性化、趨化過程以及TRPC1在其中起什么作用,對膜電流有什么影響。 方法 1.采用經(jīng)典的密度梯度離心法急性分離人嗜中性粒細(xì)胞,主要包括Dextran沉降,標(biāo)準(zhǔn)的梯度密度離心和低滲裂解殘存紅細(xì)胞三個步驟。首先使用葡聚糖T-500(Dextran-T500)沉降紅細(xì)胞,接著淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心,最后殘存紅細(xì)胞再裂解。獲得的中性粒細(xì)胞進行瑞氏-吉姆薩染色和臺盼藍(lán)染色,分析中性粒細(xì)胞的純度、活性。 2.采用5步法拉制有芯微電極,并進行拋光處理,使用膜片鉗相應(yīng)儀器檢測電極電阻。 3.采用膜片鉗相關(guān)儀器進行中性粒細(xì)胞封接和破膜,記錄膜電容和各種處理因素后TRPC1相關(guān)電流的變化。 4.在外源趨化劑fMLP存在的情況下,使用Zigmond chamber觀察細(xì)胞受到TRPC1抗體作用的形態(tài)學(xué)變化。 5.通過Transwell小室實驗檢測中性粒細(xì)胞的定向遷移率的變化。 結(jié)果 1.5步拉制并經(jīng)拋光處理的微電極電阻為5-7MΩ。 2.人嗜中性粒細(xì)胞膜電容(Cm)為14.58pF。 3. TRPC1抗體、GsMTx-4均能引起中性粒細(xì)胞膜電流的下降,與對照組或/和fMLP組比較,電流密度變化均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 4.TRPC1抗體能降低fMLP誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞極性率。 5. TRPC1抗體、GsMTx-4均能導(dǎo)致人嗜中性粒細(xì)胞趨化能力的降低。 結(jié)論 1. TRPC1抗體和GsMTx-4均能降低fMLP誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞極性化膜電流,具有阻斷細(xì)胞膜電流,進而抑制細(xì)胞定向移動的作用。 2. TRPC1介導(dǎo)膜電流的變化,參與中性粒細(xì)胞定向移動,如果受到抑制,細(xì)胞定向趨化能力降低。
【關(guān)鍵詞】：人嗜中性粒細(xì)胞 極性化 TRPCC1 定向移動 膜電流
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-20
• 材料和方法20-36
• 1 實驗材料20-26
• 2 實驗方法26-34
• 3 數(shù)據(jù)處理34-36
• 結(jié)果36-65
• 1 TRPC1抗體對fMLP誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞定向遷移的影響36-55
• 2 GsMTx-4對fMLP誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞定向移動的影響55-65
• 討論65-74
• 全文小結(jié)74-75
• 參考文獻75-83
• 英文縮略詞表83-86
• 碩士期間主要成果86-87
• 致謝87-88

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 鄒珍友;黃艷;王勇;張慧;戴威;許露露;程彥偉;汪素美;;趨化劑對細(xì)胞偽足極性生長的影響研究[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技;2009年01期

2 羅瓊;蔡春青;謝翠華;楚心唯;武清宜;孟曉靜;鄒飛;;全血中性粒細(xì)胞分離方法對fMLP誘導(dǎo)極性化的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2010年07期

3 韓重陽;王曉良;;瞬時受體電位通道研究進展[J];生理科學(xué)進展;2008年01期

4 袁春華;蔡春青;鄒飛;;4℃預(yù)處理對人中性粒細(xì)胞膜電流和極性的影響[J];生理學(xué)報;2006年05期

5 武清宜;蔡春青;謝翠華;袁春華;孟曉靜;;嗜中性粒細(xì)胞在均勻濃度fMLP誘導(dǎo)極性化過程中偽足長度的變化[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報;2010年04期

  本文關(guān)鍵詞：TRPC1在fMLP誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞定向移動中作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：335813