本文關(guān)鍵詞：Pim-2基因?qū)θ毖鯊?fù)氧條件下H9c2細(xì)胞凋亡的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 通過建立H9c2大鼠心肌樣細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型（A/R），采用Western Blot技術(shù)來檢測(cè)Pim-2蛋白在不同缺氧復(fù)氧時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)及其變化規(guī)律。通過構(gòu)建PCMV-Pim-2-Flag質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞來過表達(dá)Pim-2基因，探討其對(duì)缺氧復(fù)氧條件下H9c2細(xì)胞凋亡的影響。 方法： H9c2大鼠心肌樣細(xì)胞購于上海中科院細(xì)胞庫，用含有10%滅活的胎牛血清、含有工作濃度分別為100U/ml，0.1mg/ml青霉素、鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基于37℃、飽和濕度的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基，細(xì)胞生長融合率達(dá)到90%左右時(shí)開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 1配置缺氧液，利用缺氧液和缺氧復(fù)氧裝置，建立H9c2細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型，分別取2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h為缺氧培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，以常規(guī)培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞作為對(duì)照，Western Blot檢測(cè)Pim-2蛋白的表達(dá)。取Pim-2蛋白表達(dá)的峰值時(shí)間為缺氧時(shí)間點(diǎn)。取0h、2h、4h、8h、10h為復(fù)氧培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，Western Blot檢測(cè)Pim-2蛋白的表達(dá)，此時(shí)Pim-2表達(dá)的高峰時(shí)間點(diǎn)即為本實(shí)驗(yàn)缺氧復(fù)氧的時(shí)間點(diǎn)。 2將本實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建的PCMV-Pim-2-Flag和PCMV-flag質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組：○1空白對(duì)照組；○2缺氧復(fù)氧組：步驟1所選擇出的缺氧復(fù)氧時(shí)間點(diǎn)；○3PCMV-Pim-2-Flag+缺氧復(fù)氧組；○4PCMV-Pim-2-Flag組；○5PCMV-Flag+缺氧復(fù)氧組；○6PCMV-Flag組。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞凋亡，Western Blot、PCR分別檢測(cè)Pim-2mRNA水平及蛋白水平的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.Pim-2基因轉(zhuǎn)染對(duì)H9c2心肌細(xì)胞A/R損傷后凋亡的影響 與正常組相比，A/R組的細(xì)胞凋亡率明顯增高（5.103±0.136%vs22.81±0.425%，P＜0.05）。與A/R組及PCMV-Flag+A/R組相比，過表達(dá)Pim-2基因+A/R組即PCMV-Pim-2-Flag+A/R組的細(xì)胞凋亡率明顯降低（22.81±0.425%vs14.55±0.021%，P＜0.05；23.267±0.41%vs14.55±0.021%，P＜0.05）。與正常組相比，PCMV-Pim-2-Flag組和PCMV-Flag組的細(xì)胞凋亡率無明顯差別（5.103±0.136%vs5.25±0.59%，P＞0.05；5.103±0.136%vs5.45±0.15%，，P＞0.05）結(jié)果顯示過表達(dá)Pim-2基因能抵抗缺氧復(fù)氧條件下誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡。 2.A/R條件對(duì)H9c2細(xì)胞Pim-2mRNA表達(dá)的影響 與正常組相比，A/R組的Pim-2mRNA的表達(dá)明顯升高（0.399±0.110vs0.441±0.014，P＜0.05）。與PCMV-Pim-2-Flag組、A/R組和PCMV-Flag+A/R比，過表達(dá)Pim-2基因+A/R組即PCMV-Pim-2-Flag+A/R組的mRNA表達(dá)增加（0.541±0.015vs0.694±0.018，P＜0.05；0.441±0.014vs0.694±0.018，P＜0.05；0.456±0.010vs0.694±0.018，P＜0.05）。與正常組相比，PCMV-Flag組Pim-2mRNA表達(dá)無明顯差別（0.399±0.110vs0.389±0.010，P＞0.05）。證明A/R能誘導(dǎo)Pim-2mRNA表達(dá)的增加，轉(zhuǎn)染后Pim-2mRNA獲得了高水平表達(dá)。 3.A/R條件對(duì)H9c2細(xì)胞Pim-2蛋白表達(dá)的影響 H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)A/R干預(yù)后，各缺氧復(fù)氧組Pim-2蛋白的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯升高且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，取Pim-2蛋白的表達(dá)的峰值時(shí)間點(diǎn)缺氧12h/2h作為缺氧復(fù)氧干預(yù)條件（1.672±0.065vs1.514±0.067，P＜0.05）。轉(zhuǎn)染Pim-2重組載體后，實(shí)驗(yàn)分6組進(jìn)行。與正常組相比，A/R組的Pim-2蛋白的表達(dá)明顯升高（1.514±0.067vs1.636±0.029，P＜0.05）。與PCMV-Pim-2-Flag組、A/R組和PCMV-Flag+A/R比，過表達(dá)Pim-2基因+A/R組即PCMV-Pim-2-Flag+A/R組的蛋白表達(dá)增加（1.784±0.062vs1.930±0.065，P＜0.05；1.636±0.029vs1.930±0.065，P＜0.05；1.659±0.033vs1.930±0.065，P＜0.05）。與正常組相比，PCMV-Flag組Pim-2蛋白表達(dá)無明顯差別（1.514±0.067vs1.517±0.052，P＞0.05）。證明A/R能誘導(dǎo)Pim-2蛋白表達(dá)的增加，轉(zhuǎn)染后Pim-2蛋白獲得了高水平表達(dá)。 結(jié)論： A/R能誘導(dǎo)H9c2大鼠心肌樣細(xì)胞凋亡，正常條件下Pim-2基因呈低表達(dá)狀態(tài)，A/R能增加Pim-2基因的表達(dá)，以缺氧12h復(fù)氧2h最為明顯。過表達(dá)Pim-2基因能抵抗缺氧復(fù)氧條件下誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：Pim-2基因 H9c2心肌細(xì) 缺氧復(fù)氧損傷 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-11
• 中英文縮略詞表11-12
• 第1章 引言12-14
• 第2章 材料與方法14-27
• 2.1 材料14-18
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及質(zhì)粒14
• 2.1.2 主要試劑14-15
• 2.1.3 自配試劑15-18
• 2.1.4 主要設(shè)備18
• 2.2 方法18-27
• 2.2.1 H9c2 大鼠心肌樣細(xì)胞的培養(yǎng)18-20
• 2.2.2 H9c2 心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的建立20
• 2.2.3 基因轉(zhuǎn)染20-21
• 2.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡21-22
• 2.2.5 PCR 檢測(cè)22-24
• 2.2.6 Western Blot 檢測(cè)24-26
• 2.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析26-27
• 第3章 結(jié)果27-34
• 3.1 A/R 條件對(duì) H9c2 細(xì)胞 Pim-2 蛋白表達(dá)的影響27-30
• 3.2 Pim-2 基因轉(zhuǎn)染對(duì) H9c2 細(xì)胞 A/R 損傷后凋亡的影響30-32
• 3.3 A/R 條件對(duì) H9c2 細(xì)胞 Pim-2 mRNA 表達(dá)的影響32-34
• 第4章 討論34-38
• 4.1 心肌細(xì)胞的凋亡在缺血再灌注損傷中的作用34-35
• 4.2 Pim 家族的結(jié)構(gòu)功能35-36
• 4.3 Pim-2 基因在 H9c2 心肌細(xì)胞凋亡過程的作用36-38
• 第5章 結(jié)論38-39
• 致謝39-40
• 參考文獻(xiàn)40-43
• 綜述43-47
• 參考文獻(xiàn)46-47

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 李小燕;朱水山;劉亮明;黃緣;;pim-3基因的分子生物學(xué)特性及作用[J];醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志;2008年02期

2 李龍標(biāo);陸培榮;張學(xué)光;;絲/酪氨酸蛋白激酶PIM3在小鼠眼部組織的表達(dá)及分布[J];蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年05期

3 劉亮明;鄧歡;張吉翔;羅杰;孫水林;尹東;;絲/蘇氨酸激酶Pim-3基因?qū)毙愿喂δ芩ソ吒伪Ｗo(hù)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華消化雜志;2006年09期

4 丁鋼,沈景霞,黃永麟;心肌缺血再灌注損傷中一氧化氮與中性粒細(xì)胞之間的關(guān)系[J];心血管病學(xué)進(jìn)展;2000年05期

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本文編號(hào)：335437