目的探究成骨分化脂肪干細(xì)胞（ADSCs）來源的外泌體對ADSCs-絲素/殼聚糖三維支架復(fù)合物（ADSCs-SF/CS）的成骨效應(yīng)。方法體外提取、培養(yǎng)和鑒定ADSCs,采用冷凍干燥法制備三維支架。將ADSCs誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞,超速離心提取外泌體。將ADSCs接種于支架上,掃描電鏡觀察。將細(xì)胞支架復(fù)合體分為普通培養(yǎng)液組（陰性對照組）、成骨誘導(dǎo)液組（陽性對照組）、普通培養(yǎng)液加外泌體組（實驗組a）、成骨誘導(dǎo)液加外泌體組（實驗組b）,連續(xù)培養(yǎng)14 d后,采用Western blotting檢測成骨相關(guān)蛋白Runx2的表達(dá)量以證實ADSCs成骨分化,并通過CCK-8法及堿性磷酸酶（ALP）活性檢測探究外泌體對ADSCs-SF/CS復(fù)合物中ADSCs體外增殖及成骨分化效應(yīng)的作用。結(jié)果 CCK-8結(jié)果顯示,實驗組a與陰性對照組相比,加入外泌體有利于ADSCs的增殖,Runx2及ALP活性結(jié)果顯示,實驗組b與陽性對照組相比,加入外泌體可使ADSCs-SF/CS復(fù)合物中的ADSCs成骨效應(yīng)顯著增強(qiáng)。結(jié)論成骨誘導(dǎo)后,ADSCs來源的外泌體可誘導(dǎo)附著于SF/CS上的ADSCs向成骨細(xì)胞分化,并且對ADSCs的成... 

【文章來源】：中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報. 2019,48(10)北大核心CSCD

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倒置顯微鏡下可見原代培養(yǎng)5d后ADSCs增長活躍×100Fig.1Imageunderaninvertedmicroscope：adipocytegrowth

懸浮于培養(yǎng)液中，24h可全部貼壁，初期細(xì)胞體積較小，呈紡錘形或梭形；72h細(xì)胞體積逐漸增大，呈梭形；120h梭形細(xì)胞大量增殖，局部呈平行或漩渦狀緊密排列（圖1）。分別用油紅O、茜素紅及甲苯胺藍(lán)染色，鏡下所見證實ADSCs具有向成熟的脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞多向分化的潛能（圖2）。A，ADSCswereinducedtodifferentiateintoadipocytes（oilredOstaining）；B，ADSCswereinducedtodifferentiateintoosteoblasts（alizarinredstain-ing）；C，ADSCswereinducedtodifferentiateintochondrocytes（toluidinebluestaining）.圖2ADSCs向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化21d×100Fig.2ADSCswereinducedtodifferentiateintoadipocytes，osteoblasts，andchondrocytesafterbeingfosteredfor21d×100圖1倒置顯微鏡下可見原代培養(yǎng)5d后ADSCs增長活躍×100Fig.1Imageunderaninvertedmicroscope：adipocytegrowthwasactiveafterprimaryculturingfor5days×1002.2外泌體的形態(tài)及鑒定透射電鏡下可見外泌體直徑介于40~100nm之間，為具有明顯雙層膜結(jié)構(gòu)的圓形杯盤狀囊泡（圖3）。應(yīng)用BCA蛋白濃度試劑盒測得平均每180mL上清可提取外泌體蛋白濃度約為1.340μg/μL。West-ernblotting法以β-actin內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，可見成骨誘導(dǎo)21d的ADSCs及提取的外泌體中均有CD9和CD63標(biāo)記蛋白表達(dá)，進(jìn)一步證實提取的外泌體來源于成骨分化的ADSCs（圖4）。2.3ADSCs-SF/CS復(fù)合物在外泌體誘導(dǎo)下的成骨效應(yīng)2.3.1掃描電鏡下觀察細(xì)胞在支架內(nèi)附著情況：電鏡下可見SF/CS材料呈多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙的走向沒有方向性。孔徑大小從數(shù)十到300μm不等，孔與孔之間相連通，孔隙內(nèi)壁平滑平整（圖5），培養(yǎng)1周時支架表面及孔隙中可見ADSCs黏附，細(xì)胞與支架材料緊密黏接，偽足向各個?

/μL。West-ernblotting法以β-actin內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，可見成骨誘導(dǎo)21d的ADSCs及提取的外泌體中均有CD9和CD63標(biāo)記蛋白表達(dá)，進(jìn)一步證實提取的外泌體來源于成骨分化的ADSCs（圖4）。2.3ADSCs-SF/CS復(fù)合物在外泌體誘導(dǎo)下的成骨效應(yīng)2.3.1掃描電鏡下觀察細(xì)胞在支架內(nèi)附著情況：電鏡下可見SF/CS材料呈多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙的走向沒有方向性�？讖酱笮臄�(shù)十到300μm不等，孔與孔之間相連通，孔隙內(nèi)壁平滑平整（圖5），培養(yǎng)1周時支架表面及孔隙中可見ADSCs黏附，細(xì)胞與支架材料緊密黏接，偽足向各個方向伸展，細(xì)胞周圍可見細(xì)圖3外泌體透射電鏡圖×80000Fig.3Exosomesobservedunderatransmissionelectronmi-croscope×80000ABC第10期魏松喬等.脂肪干細(xì)胞-絲素/殼聚糖支架復(fù)合物在外泌體誘導(dǎo)下的體外成骨效應(yīng)


本文編號：3345873