本文關(guān)鍵詞：上游刺激因子2（USF2）對(duì)Smurf1和Smurf2的功能調(diào)控研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的： 證明USF2是泛素連接酶Smurf1和Smurf2的負(fù)性轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)Smurf1/2在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平上有抑制作用,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討,更進(jìn)一步研究USF2對(duì)Smurf1/2的發(fā)揮抑制作用的功能區(qū)域。 研究方法： 一.USF2與其截短體真核表達(dá)載體的構(gòu)建 1Myc-USF2與其截短體Myc-USF2(1-235aa)、Myc-USF2(236-346aa)的構(gòu)建 根據(jù)USF2基因序列設(shè)計(jì)PCR引物,提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA文庫(kù)。再以cDNA為模板,分別取USF2、USF2(1-235aa)、 USF2(236-346aa)上下游引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的基因片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、回收、酶切后,插入pCMV-Myc的多克隆位點(diǎn)KpnI和SalI之間。連接產(chǎn)物經(jīng)E.coli DH5α菌株轉(zhuǎn)化后,挑取單克隆并提取質(zhì)粒,經(jīng)限制性雙酶切鑒定后,陽(yáng)性克隆送測(cè)序測(cè)序,測(cè)序正確的即為Myc-USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)。 2.轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞驗(yàn)證重組質(zhì)粒的表達(dá) 各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時(shí)后,收取細(xì)胞,制作蛋白樣品,后經(jīng)由Westernblot驗(yàn)證其在真核細(xì)胞中的正確表達(dá)。 二.USF2對(duì)Smurf1、 Smurf2的功能調(diào)控研究 1Smurf1/2對(duì)USF2的調(diào)控作用 梯度轉(zhuǎn)染Flag-Smurf1或Flag-Smurf2,48小時(shí)后,收取并裂解細(xì)胞,制作蛋白樣品,經(jīng)Western blot驗(yàn)證其在細(xì)胞中對(duì)USF2的調(diào)控作用。內(nèi)源性免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Smurfs和USF2是否存在相互作用,實(shí)驗(yàn)組使用USF2抗體進(jìn)行IP,對(duì)照組使用小鼠Normal IgG抗體,Smurf1抗體和Smurf2抗體檢測(cè)IP樣品,以此判斷USF2與Smurf1或Smurf2之間有無(wú)相互作用。 2.USF2抑制Smurf1/2的轉(zhuǎn)錄表達(dá) 梯度過(guò)表達(dá)Myc-USF2, Western blot檢測(cè)Smurf1/2的蛋白水平的變化,再利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)Smurf1/2的mRNA水平,檢測(cè)USF2對(duì)Smurf1/2蛋白及轉(zhuǎn)錄水平的影響。為了進(jìn)一步驗(yàn)證USF2對(duì)Smurf1/2的調(diào)節(jié)作用,細(xì)胞中依次轉(zhuǎn)染USF2siRNA及Control siRNA,敲低細(xì)胞內(nèi)源USF2,再分別利用Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)Smurf1/2蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平的變化。利用生物信息學(xué)段分析Smurf1/2的啟動(dòng)子區(qū)是否含有E-box結(jié)構(gòu)域,之后構(gòu)建了含有Smurf1/2promoter區(qū)E-box結(jié)構(gòu)域的PGL3-enhance報(bào)告基因載體,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來(lái)驗(yàn)證USF2對(duì)Smurf1/2啟動(dòng)子活性的抑制作用。 3.USF2結(jié)合Smurf1/2啟動(dòng)子區(qū) 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn),來(lái)確認(rèn)USF2可以結(jié)合Smurf1/2啟動(dòng)子區(qū),進(jìn)一步證實(shí)USF2是Smurf1/2的轉(zhuǎn)錄抑制因子。首先設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行體內(nèi)染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn),從而證實(shí)在體內(nèi)USF2可以結(jié)合Smurf1/2啟動(dòng)子區(qū)。為了確證USF2在體外可以直接結(jié)合Smurf1/2啟動(dòng)子區(qū),我們首先純化GST-USF2蛋白,并驗(yàn)證其正確表達(dá),然后制作包含Smurf1/2E-box結(jié)構(gòu)域的生物素標(biāo)記探針,進(jìn)行體外凝膠遷移(EMSA)實(shí)驗(yàn)。其中,為了進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)果的可靠性和確認(rèn)USF2和Smurf1/2promoter區(qū)結(jié)合的特異性,我們?cè)O(shè)計(jì)了冷探針競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn),即使用不同高濃度的未標(biāo)記生物素的冷探針和突變冷探針,競(jìng)爭(zhēng)生物素探針與USF2蛋白的結(jié)合。另外我們使用USF2抗體,進(jìn)行超阻滯實(shí)驗(yàn),以排除其他基因或非特異性蛋白帶來(lái)的影響。 三.USF2對(duì)Smur1/2發(fā)揮抑制效應(yīng)功能區(qū)的研究 將Myc-USF2、Myc-USF2(1-235aa)、Myc-USF2(236-346aa)轉(zhuǎn)染到MCF7細(xì)胞中,48h后收集并裂解細(xì)胞,通過(guò)Western blot及實(shí)時(shí)定量PCR確定USF2抑制Smurf1/2轉(zhuǎn)錄水平的具體功能區(qū)域。 研究結(jié)果： 一.USF2與其截短體真核表達(dá)載體的構(gòu)建 1.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒Myc-USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)。 挑取陽(yáng)性克隆,提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定,將酶切陽(yáng)性結(jié)果送測(cè)序,測(cè)序正確的重組質(zhì)粒說(shuō)明Myc-USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)構(gòu)建成功。 2.轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞重組質(zhì)粒的正確表達(dá) 將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,經(jīng)Western blot驗(yàn)證其在真核細(xì)胞中能夠正確表達(dá)。 二.USF2對(duì)Smurfl1、Smurf2的功能調(diào)控研究 1Smurf1/2對(duì)USF2無(wú)調(diào)控作用 梯度轉(zhuǎn)染Flag-Smurf1或Flag-Smurf2,由Western blot驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)USF2蛋白水平不隨著Smurf1/2的變化而變化,初步認(rèn)為USF2不是Smurf1/2的泛素化底物。而后進(jìn)行的內(nèi)源性Co-IP實(shí)驗(yàn)證明,和使用Normal IgG抗體的對(duì)照組一樣,使用USF2抗體進(jìn)行IP的實(shí)驗(yàn)組沒(méi)有檢測(cè)到Smurf1或Smurf2,說(shuō)明USF2與Smurfs之間無(wú)相互作用。 2.USF2對(duì)Smurf1/2轉(zhuǎn)錄有抑制作用 梯度轉(zhuǎn)染Myc-USF2, Western blot檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)Smurf1/2的蛋白水平呈現(xiàn)梯度下降,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Smurf1/2的mRNA水平也下降,說(shuō)明USF2對(duì)Smurfs的蛋白水平和mRNA水平均有抑制作用。敲低細(xì)胞內(nèi)源USF2后則得到相反的效應(yīng)。為了確證USF2對(duì)Smurfs是在轉(zhuǎn)錄水平還是轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮抑制作用,我們構(gòu)建了含有Smurf1/2promoter區(qū)E-box結(jié)構(gòu)域的PGL3-enhance報(bào)告基因,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)USF2對(duì)Smurf1/2轉(zhuǎn)錄活性具有明顯的抑制作用,敲低反之。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)USF2對(duì)Smurf1/2是在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮了抑制作用而最終導(dǎo)致其大蛋白水平的降低。 3.USF2結(jié)合Smurf1/2啟動(dòng)子區(qū) ChIP實(shí)驗(yàn)明確USF2在體內(nèi)可以結(jié)合Smurf1/2的啟動(dòng)子,證實(shí)USF2是Smurf1/2的轉(zhuǎn)錄因子。純化GST-USF2蛋白,Western blot并驗(yàn)證其正確表達(dá)。進(jìn)行體外EMSA實(shí)驗(yàn),結(jié)果得到USF2和Smurf12promoter區(qū)結(jié)合能夠產(chǎn)生DNA-蛋白復(fù)合體,即說(shuō)明USF2在體外可以直接結(jié)合Smurf1/2的啟動(dòng)子。使用不同高濃度的冷探針,可以成功競(jìng)爭(zhēng)生物素探針與USF2蛋白的結(jié)合；而使用突變探針后,DNA-蛋白復(fù)合體結(jié)合條帶消失,從而進(jìn)一步確證USF2特異的結(jié)合Smurf1/2的啟動(dòng)子。另外,使用USF2抗體進(jìn)行EMSA超阻滯實(shí),發(fā)現(xiàn)結(jié)合條帶遷移明顯滯后。以上說(shuō)明USF2特異性結(jié)合Smurf1/2啟動(dòng)子區(qū)。 三.USF2對(duì)Smur1/2發(fā)揮抑制效應(yīng)功能區(qū)的研究 轉(zhuǎn)染Myc-USF2、Myc-USF2(1-235aa)、Myc-USF2(236-346aa)48h后,Western blot及實(shí)時(shí)定量PCR,發(fā)現(xiàn)Myc-USF2、Myc-USF2(236-346aa)對(duì)Smurf1/2的蛋白及轉(zhuǎn)錄水平有抑制作用,而Myc-USF2(1-235aa)不具備抑制效應(yīng),說(shuō)明對(duì)Smurf1/2發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制的功能區(qū)域主要是USF2的第236到第346氨基酸之間的區(qū)域。 結(jié)論及意義： 本研究首次發(fā)現(xiàn)了Smurf1和Smurf2的負(fù)性轉(zhuǎn)錄因子——USF2,它可以抑制Smurf1/2的轉(zhuǎn)錄水平,從而降低其蛋白的表達(dá),同時(shí)證明了USF2對(duì)Smurf1/2的負(fù)性調(diào)節(jié)作用主要是通過(guò)USF2端第236到346氨基酸之間的區(qū)域發(fā)揮的。這為進(jìn)一步研究Smurf1/2分子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,及USF2生理功能的深入探討奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：USF2 Smurf1 Smurf2：轉(zhuǎn)錄因子 負(fù)調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-15
• 符號(hào)說(shuō)明15-16
• 前言16-20
• 第一章 USF2與其截短體真核表達(dá)載體的構(gòu)建20-29
• 1.材料20-21
• 2.方法21-27
• 3.結(jié)果27
• 4.討論27-29
• 第二章 USF2對(duì)Smurf1、Smurf2的功能調(diào)控研究29-43
• 1. Smurf1/2對(duì)USF2的調(diào)控作用29-31
• 2. USF2對(duì)Smurf1/2的轉(zhuǎn)錄抑制作用31-35
• 3. USF2與Smur1/2啟動(dòng)子區(qū)的特異性結(jié)合35-41
• 4. 討論41-43
• 第三章 USF2對(duì)Smur1/2發(fā)揮抑制效應(yīng)功能區(qū)的研究43-46
• 1.材料43-44
• 2.方法44
• 3.結(jié)果44
• 4.討論44-46
• 小結(jié)46-47
• 附圖47-53
• 附錄53-57
• 參考文獻(xiàn)57-60
• 致謝60-62
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文62-63
• 附件63

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2 林海燕,王紅梅,祝誠(chéng);泛素-蛋白水解酶復(fù)合體通路對(duì)Smad通路的調(diào)節(jié)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).分子生物學(xué)分冊(cè);2003年04期

3 李穎;何威;何云志;黃海;王亞麗;楊揚(yáng);;脂溢性角化病皮損區(qū)Smurf1和Smurf2表達(dá)增強(qiáng)[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2007年10期

4 馬立彬;鄧剛;劉曉城;徐鋼;葉章群;;甘草酸二胺對(duì)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化的治療作用及機(jī)制[J];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志;2007年06期

5 馬立彬;鄧剛;劉曉城;;PI3K抑制劑對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2表達(dá)的影響[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2007年21期

6 賈寧;王漢;劉耿容;張樺;周文英;;SnoN蛋白在慢性同種移植腎病大鼠腎組織中的表達(dá)及作用[J];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志;2011年02期

7 王啟偉,樸英杰;Smad蛋白與TGF-β超家族[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2003年04期

8 蔡瑜,沈錫中,王吉耀;四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化過(guò)程中基因表達(dá)變化的研究[J];中華消化雜志;2003年10期

9 劉忠,郭樹(shù)忠,曹煜;TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國(guó)美容醫(yī)學(xué);2004年04期

10 高中玉,林子豪,袁相斌;TGF-β基因表達(dá)調(diào)控的新進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).生理.病理科學(xué)與臨床分冊(cè);2004年03期

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1 張志;李孝建;梁達(dá)榮;李葉揚(yáng);;Smurf2及其mRNA在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達(dá)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)燒傷外科學(xué)分會(huì)2009年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

2 楊壯智;陽(yáng)韜;陳永平;林鐲;;SnoN蛋白在肝纖維化大鼠肝組織中的表達(dá)及其意義[A];第二十次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

3 陳大華;;The Niche-dependent feedback loop generates a BMP activity gradient to determine the germline stem cell fate[A];第二屆模式生物與人類健康研討會(huì)會(huì)議論文集[C];2012年

4 楊壯智;陽(yáng)韜;陳永平;林鐲;;SnoN蛋白在肝纖維化大鼠肝組織中的表達(dá)及其意義[A];第四屆中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)感染科醫(yī)師大會(huì)暨傳染病診治高峰論壇、浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)肝病、感染病學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2011年

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1 評(píng)測(cè)工程師 秦鋼 李韜;主動(dòng)的4到7層防御主動(dòng)的[N];計(jì)算機(jī)世界;2004年

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1 盧克峰;HECT類泛素連接酶Smurf1活性調(diào)控、新功能及相關(guān)晶體結(jié)構(gòu)研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2010年

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3 崔宇;SCF~(FBXL15)復(fù)合體促進(jìn)HECT類泛素連接酶Smurf1的降解及其在BMP信號(hào)通路中的功能研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

4 李平;人源2OS蛋白酶體激活因子REGγ結(jié)構(gòu)與功能研究[D];南開(kāi)大學(xué);2013年

5 李曉照;Arkadia-Smad7介導(dǎo)TGF-β信號(hào)通路的正向調(diào)控與腎纖維化的關(guān)系[D];中南大學(xué);2007年

6 蔡瑜;E3連接酶Smurf2在肝病中的作用機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

7 黃永勝;RLIM增強(qiáng)TGF-β和BMP通路活性的機(jī)制研究及TGF-β基因多態(tài)性與乳腺癌相關(guān)性的Meta-分析[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

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9 馬鳴飛;芪衛(wèi)顆粒治療DN臨床觀察及調(diào)節(jié)PEDF/USF_2表達(dá)對(duì)DN腎纖維化的干預(yù)機(jī)制研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2013年

10 付曉;益氣解毒活絡(luò)法對(duì)早期糖尿病腎病大鼠TGF-Smads-UPP通路的影響[D];遼寧中醫(yī)藥大學(xué);2012年

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1 譚雅文;上游刺激因子2（USF2）對(duì)Smurf1和Smurf2的功能調(diào)控研究[D];山東大學(xué);2013年

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3 王藝芳;CKIP-1作為接頭蛋白偶聯(lián)Smurf1與蛋白酶體的相關(guān)研究[D];北京工業(yè)大學(xué);2012年

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7 李穎;脂溢性角化病、基底細(xì)胞癌及鱗狀細(xì)胞癌中Ⅰ型和Ⅱ型TGFβ受體、Smad7、Smurf1和2的表達(dá)[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2006年

8 劉昌玲;Smurf2對(duì)增生性瘢痕TGF-β1信號(hào)通路負(fù)向調(diào)節(jié)因子Smad7的影響及其機(jī)制的研究[D];暨南大學(xué);2013年

9 孫蕓;尋常型銀屑病皮損區(qū)Smad7、Smurf1和Smurf2的表達(dá)[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2005年

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  本文關(guān)鍵詞：上游刺激因子2（USF2）對(duì)Smurf1和Smurf2的功能調(diào)控研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：332259