發(fā)布時間：2017-04-28 06:07

  本文關(guān)鍵詞：上游刺激因子2（USF2）對Smurf1和Smurf2的功能調(diào)控研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的： 證明USF2是泛素連接酶Smurf1和Smurf2的負性轉(zhuǎn)錄因子,對Smurf1/2在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平上有抑制作用,并對其作用機制進行初步探討,更進一步研究USF2對Smurf1/2的發(fā)揮抑制作用的功能區(qū)域。 研究方法： 一.USF2與其截短體真核表達載體的構(gòu)建 1Myc-USF2與其截短體Myc-USF2(1-235aa)、Myc-USF2(236-346aa)的構(gòu)建 根據(jù)USF2基因序列設(shè)計PCR引物,提取細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA文庫。再以cDNA為模板,分別取USF2、USF2(1-235aa)、 USF2(236-346aa)上下游引物,進行PCR擴增得到目的基因片段。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、回收、酶切后,插入pCMV-Myc的多克隆位點KpnI和SalI之間。連接產(chǎn)物經(jīng)E.coli DH5α菌株轉(zhuǎn)化后,挑取單克隆并提取質(zhì)粒,經(jīng)限制性雙酶切鑒定后,陽性克隆送測序測序,測序正確的即為Myc-USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)。 2.轉(zhuǎn)染真核細胞驗證重組質(zhì)粒的表達 各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞48小時后,收取細胞,制作蛋白樣品,后經(jīng)由Westernblot驗證其在真核細胞中的正確表達。 二.USF2對Smurf1、 Smurf2的功能調(diào)控研究 1Smurf1/2對USF2的調(diào)控作用 梯度轉(zhuǎn)染Flag-Smurf1或Flag-Smurf2,48小時后,收取并裂解細胞,制作蛋白樣品,經(jīng)Western blot驗證其在細胞中對USF2的調(diào)控作用。內(nèi)源性免疫共沉淀(Co-IP)實驗驗證Smurfs和USF2是否存在相互作用,實驗組使用USF2抗體進行IP,對照組使用小鼠Normal IgG抗體,Smurf1抗體和Smurf2抗體檢測IP樣品,以此判斷USF2與Smurf1或Smurf2之間有無相互作用。 2.USF2抑制Smurf1/2的轉(zhuǎn)錄表達 梯度過表達Myc-USF2, Western blot檢測Smurf1/2的蛋白水平的變化,再利用實時定量PCR技術(shù)檢測Smurf1/2的mRNA水平,檢測USF2對Smurf1/2蛋白及轉(zhuǎn)錄水平的影響。為了進一步驗證USF2對Smurf1/2的調(diào)節(jié)作用,細胞中依次轉(zhuǎn)染USF2siRNA及Control siRNA,敲低細胞內(nèi)源USF2,再分別利用Western blot和實時定量PCR技術(shù)檢測Smurf1/2蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平的變化。利用生物信息學段分析Smurf1/2的啟動子區(qū)是否含有E-box結(jié)構(gòu)域,之后構(gòu)建了含有Smurf1/2promoter區(qū)E-box結(jié)構(gòu)域的PGL3-enhance報告基因載體,通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀬眚炞CUSF2對Smurf1/2啟動子活性的抑制作用。 3.USF2結(jié)合Smurf1/2啟動子區(qū) 本實驗設(shè)計體內(nèi)、體外實驗,來確認USF2可以結(jié)合Smurf1/2啟動子區(qū),進一步證實USF2是Smurf1/2的轉(zhuǎn)錄抑制因子。首先設(shè)計引物,進行體內(nèi)染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實驗,從而證實在體內(nèi)USF2可以結(jié)合Smurf1/2啟動子區(qū)。為了確證USF2在體外可以直接結(jié)合Smurf1/2啟動子區(qū),我們首先純化GST-USF2蛋白,并驗證其正確表達,然后制作包含Smurf1/2E-box結(jié)構(gòu)域的生物素標記探針,進行體外凝膠遷移(EMSA)實驗。其中,為了進一步確認結(jié)果的可靠性和確認USF2和Smurf1/2promoter區(qū)結(jié)合的特異性,我們設(shè)計了冷探針競爭實驗,即使用不同高濃度的未標記生物素的冷探針和突變冷探針,競爭生物素探針與USF2蛋白的結(jié)合。另外我們使用USF2抗體,進行超阻滯實驗,以排除其他基因或非特異性蛋白帶來的影響。 三.USF2對Smur1/2發(fā)揮抑制效應功能區(qū)的研究 將Myc-USF2、Myc-USF2(1-235aa)、Myc-USF2(236-346aa)轉(zhuǎn)染到MCF7細胞中,48h后收集并裂解細胞,通過Western blot及實時定量PCR確定USF2抑制Smurf1/2轉(zhuǎn)錄水平的具體功能區(qū)域。 研究結(jié)果： 一.USF2與其截短體真核表達載體的構(gòu)建 1.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒Myc-USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)。 挑取陽性克隆,提取質(zhì)粒后進行雙酶切鑒定,將酶切陽性結(jié)果送測序,測序正確的重組質(zhì)粒說明Myc-USF2、USF2(1-235aa)、USF2(236-346aa)構(gòu)建成功。 2.轉(zhuǎn)染真核細胞重組質(zhì)粒的正確表達 將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞,經(jīng)Western blot驗證其在真核細胞中能夠正確表達。 二.USF2對Smurfl1、Smurf2的功能調(diào)控研究 1Smurf1/2對USF2無調(diào)控作用 梯度轉(zhuǎn)染Flag-Smurf1或Flag-Smurf2,由Western blot驗證,發(fā)現(xiàn)USF2蛋白水平不隨著Smurf1/2的變化而變化,初步認為USF2不是Smurf1/2的泛素化底物。而后進行的內(nèi)源性Co-IP實驗證明,和使用Normal IgG抗體的對照組一樣,使用USF2抗體進行IP的實驗組沒有檢測到Smurf1或Smurf2,說明USF2與Smurfs之間無相互作用。 2.USF2對Smurf1/2轉(zhuǎn)錄有抑制作用 梯度轉(zhuǎn)染Myc-USF2, Western blot檢測后發(fā)現(xiàn)Smurf1/2的蛋白水平呈現(xiàn)梯度下降,實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)Smurf1/2的mRNA水平也下降,說明USF2對Smurfs的蛋白水平和mRNA水平均有抑制作用。敲低細胞內(nèi)源USF2后則得到相反的效應。為了確證USF2對Smurfs是在轉(zhuǎn)錄水平還是轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮抑制作用,我們構(gòu)建了含有Smurf1/2promoter區(qū)E-box結(jié)構(gòu)域的PGL3-enhance報告基因,發(fā)現(xiàn)過表達USF2對Smurf1/2轉(zhuǎn)錄活性具有明顯的抑制作用,敲低反之。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實USF2對Smurf1/2是在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮了抑制作用而最終導致其大蛋白水平的降低。 3.USF2結(jié)合Smurf1/2啟動子區(qū) ChIP實驗明確USF2在體內(nèi)可以結(jié)合Smurf1/2的啟動子,證實USF2是Smurf1/2的轉(zhuǎn)錄因子。純化GST-USF2蛋白,Western blot并驗證其正確表達。進行體外EMSA實驗,結(jié)果得到USF2和Smurf12promoter區(qū)結(jié)合能夠產(chǎn)生DNA-蛋白復合體,即說明USF2在體外可以直接結(jié)合Smurf1/2的啟動子。使用不同高濃度的冷探針,可以成功競爭生物素探針與USF2蛋白的結(jié)合；而使用突變探針后,DNA-蛋白復合體結(jié)合條帶消失,從而進一步確證USF2特異的結(jié)合Smurf1/2的啟動子。另外,使用USF2抗體進行EMSA超阻滯實,發(fā)現(xiàn)結(jié)合條帶遷移明顯滯后。以上說明USF2特異性結(jié)合Smurf1/2啟動子區(qū)。 三.USF2對Smur1/2發(fā)揮抑制效應功能區(qū)的研究 轉(zhuǎn)染Myc-USF2、Myc-USF2(1-235aa)、Myc-USF2(236-346aa)48h后,Western blot及實時定量PCR,發(fā)現(xiàn)Myc-USF2、Myc-USF2(236-346aa)對Smurf1/2的蛋白及轉(zhuǎn)錄水平有抑制作用,而Myc-USF2(1-235aa)不具備抑制效應,說明對Smurf1/2發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制的功能區(qū)域主要是USF2的第236到第346氨基酸之間的區(qū)域。 結(jié)論及意義： 本研究首次發(fā)現(xiàn)了Smurf1和Smurf2的負性轉(zhuǎn)錄因子——USF2,它可以抑制Smurf1/2的轉(zhuǎn)錄水平,從而降低其蛋白的表達,同時證明了USF2對Smurf1/2的負性調(diào)節(jié)作用主要是通過USF2端第236到346氨基酸之間的區(qū)域發(fā)揮的。這為進一步研究Smurf1/2分子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制,及USF2生理功能的深入探討奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：USF2 Smurf1 Smurf2：轉(zhuǎn)錄因子 負調(diào)控
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R3411
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-15
• 符號說明15-16
• 前言16-20
• 第一章 USF2與其截短體真核表達載體的構(gòu)建20-29
• 1.材料20-21
• 2.方法21-27
• 3.結(jié)果27
• 4.討論27-29
• 第二章 USF2對Smurf1、Smurf2的功能調(diào)控研究29-43
• 1. Smurf1/2對USF2的調(diào)控作用29-31
• 2. USF2對Smurf1/2的轉(zhuǎn)錄抑制作用31-35
• 3. USF2與Smur1/2啟動子區(qū)的特異性結(jié)合35-41
• 4. 討論41-43
• 第三章 USF2對Smur1/2發(fā)揮抑制效應功能區(qū)的研究43-46
• 1.材料43-44
• 2.方法44
• 3.結(jié)果44
• 4.討論44-46
• 小結(jié)46-47
• 附圖47-53
• 附錄53-57
• 參考文獻57-60
• 致謝60-62
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文62-63
• 附件63

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