白念珠菌是臨床常見的條件性致病真菌之一。由于重癥特護人群、免疫缺陷人群的增加及抗生素的濫用,白念珠菌感染,尤其是白念珠菌侵襲性感染備受人們關(guān)注。白念珠菌是一種典型的兩型性真菌,具有菌絲發(fā)育、生物被膜形成等形態(tài)發(fā)生能力,這些能力與該真菌的形態(tài)發(fā)生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及分泌途徑具有密切聯(lián)系。不僅如此,白念珠菌還具有極為精細的環(huán)境壓力應(yīng)答系統(tǒng),用以感應(yīng)抗真菌藥物、氧化脅迫、營養(yǎng)匱乏等諸多環(huán)境壓力,并對其作用應(yīng)答,使自身得以存活與生長。白念珠菌的形態(tài)發(fā)生與壓力應(yīng)答能力均是白念珠菌在宿主體內(nèi)進行有效定殖并造成感染所必需的,而這些能力又與白念珠菌鈣穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)的功能緊密相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與液泡是白念珠菌細胞兩種極為重要的細胞器。前者是細胞分泌途徑的核心,同時也是介導(dǎo)壓力應(yīng)答的主要細胞器。后者是白念珠菌細胞最主要的鈣庫,在調(diào)控細胞鈣穩(wěn)態(tài)方面扮演著重要角色。盡管白念珠菌鈣穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)中的許多成員已為人們所知,但維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能所必需的鈣泵尚未得到鑒定,且液泡鈣通道Yvc1的功能仍屬未知。此外,盡管人們已明確白念珠菌鈣通道在形態(tài)發(fā)生及壓力應(yīng)答過程中發(fā)揮重要功能,但目前尚無有效抑制鈣通道活性,進而指導(dǎo)臨床實踐的報道。本研究針對以上三... 

【文章來源】：南開大學(xué)天津市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    第一節(jié) 白念珠菌的生物學(xué)特性與流行病學(xué)
        1.1.1 白念珠菌的生物學(xué)特性
        1.1.2 白念珠菌的流行病學(xué)
    第二節(jié) 白念珠菌的形態(tài)發(fā)生
        1.2.1 白念珠菌形態(tài)發(fā)生概述
        1.2.2 白念珠菌兩型性轉(zhuǎn)換及其調(diào)節(jié)機制
    第三節(jié) 釀酒酵母及白念珠菌的壓力應(yīng)答機制
        1.3.1 CCS途徑
        1.3.2 ERAD途徑
        1.3.3 UPR途徑
        1.3.4 SSR途徑
        1.3.5 CWI型MAPK途徑
        1.3.6 Hog1途徑
    第四節(jié) 白念珠菌的鈣信號系統(tǒng)
        1.4.1 白念珠菌的鈣穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)
        1.4.2 白念珠菌的鈣信號途徑
    第五節(jié) 選題依據(jù)與技術(shù)路線
        1.5.1 選題依據(jù)與研究意義
        1.5.2 技術(shù)路線
第二章 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵Spf1在白念珠菌形態(tài)發(fā)生及壓力應(yīng)答過程中的功能
    第一節(jié) 實驗材料
        2.1.1 菌株、質(zhì)粒與引物
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 培養(yǎng)基
    第二節(jié) 實驗方法
        2.2.1 白念珠菌的轉(zhuǎn)化
        2.2.2 大腸桿菌的CaCl_2法轉(zhuǎn)化
        2.2.3 大腸桿菌質(zhì)粒的提取
        2.2.4 白念珠菌及釀酒酵母基因組的提取
        2.2.5 白念珠菌Spf1蛋白C端的標(biāo)記
        2.2.6 白念珠菌SPF1基因的敲除
        2.2.7 Southern blotting
        2.2.8 白念珠菌總蛋白的提取
        2.2.9 Spf1蛋白的提取、純化與檢測
        2.2.10 ATPase活性分析
        2.2.11 Western blotting
        2.2.12 白念珠菌生長曲線的測定
        2.2.13 白念珠菌菌絲誘導(dǎo)
        2.2.14 白念珠菌絮凝能力測定
        2.2.15 白念珠菌粘附能力測定
        2.2.16 白念珠菌生物被膜形成能力測定
        2.2.17 白念珠菌敏感性測定
        2.2.18 白念珠菌毒力分析
    第三節(jié) 結(jié)果與分析
        2.3.1 白念珠菌鈣泵Spf1的鑒定
        2.3.2 Spf1蛋白的純化及酶學(xué)特性
        2.3.3 白念珠菌SPF1基因敲除菌株及其回補株的構(gòu)建
        2.3.4 SPF1基因缺失對白念珠菌正常生長速率的影響
        2.3.5 SPF1基因缺失對白念珠菌形態(tài)發(fā)生能力的影響
        2.3.6 SPF1基因缺失對白念珠菌壓力應(yīng)答能力的影響
        2.3.7 SPF1基因缺失對白念珠菌毒力的影響
    第四節(jié) 討論
        2.4.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵Spf1蛋白的鑒定
        2.4.2 Spf1在白念珠菌正常生長過程中的功能
        2.4.3 Spf1在白念珠菌形態(tài)發(fā)生中的功能
        2.4.4 Spf1在白念珠菌壓力應(yīng)答中的功能
        2.4.5 Spf1在白念珠菌致病過程中的作用
    第五節(jié) 小結(jié)
第三章 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵Spf1在白念珠菌形態(tài)發(fā)生及壓力應(yīng)答過程中的作用機制
    第一節(jié) 實驗材料
        3.1.1 菌株、質(zhì)粒與引物
        3.1.2 主要儀器
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 培養(yǎng)基
    第二節(jié) 實驗方法
        3.2.1 大腸桿菌的電轉(zhuǎn)化
        3.2.2 釀酒酵母的轉(zhuǎn)化
        3.2.3 白念珠菌Cdcl01的血凝素(HA)標(biāo)記
        3.2.4 白念珠菌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能基因SEC61啟動子報告質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.5 白念珠菌胞質(zhì)鈣及總鈣含量的測定
        3.2.6 分泌型酸性磷酸酶(SAP)分析
        3.2.7 內(nèi)切糖苷酶(EndoH)分析
        3.2.8 白念珠菌細胞壁組成分析
        3.2.9 白念珠菌細胞壁壓力敏感性測定
        3.2.10 白念珠菌原生質(zhì)體制備及再生
        3.2.11 β-半乳糖苷酶活性分析
        3.2.12 白念珠菌RNA提取、基因組DNA消化及RNA反轉(zhuǎn)錄
        3.2.13 實時定量PCR(RT-PCR)
        3.2.14 其他方法
    第三節(jié) 結(jié)果與分析
        3.3.1 SPF1基因缺失對白念珠菌鈣穩(wěn)態(tài)的影響
        3.3.2 SPF1基因缺失對白念珠菌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的影響
        3.3.3 SPF1基因缺失對白念珠菌細胞壁組成與功能的影響
        3.3.4 SPF1基因缺失對白念珠菌基因表達的影響
    第四節(jié) 討論
        3.4.1 Spf1在白念珠菌細胞鈣穩(wěn)態(tài)維持中的作用
        3.4.2 Spf1在白念珠菌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能維持中的作用
        3.4.3 Spf1在白念珠菌CWI維持中的作用
        3.4.4 SPF1基因缺失對白念珠菌基因表達的影響
    第五節(jié) 小結(jié)
第四章 液泡鈣通道Yvc1在白念珠菌形態(tài)發(fā)生及壓力應(yīng)答中的作用
    第一節(jié) 實驗材料
        4.1.1 菌株、質(zhì)粒與引物
        4.1.2 主要儀器
        4.1.3 主要試劑
    第二節(jié) 實驗方法
        4.2.1 YVC1回補質(zhì)粒pDDB78-YVC1的構(gòu)建
        4.2.2 YVC1回補菌株及URA3原位回補菌株的構(gòu)建
        4.2.3 白念珠菌生長曲線的測定
        4.2.4 胞質(zhì)鈣濃度檢測
        4.2.5 菌絲誘導(dǎo)
        4.2.6 侵染式生長能力測定
        4.2.7 絮凝能力測定
        4.2.8 生物被膜形成能力測定
        4.2.9 白念珠菌氧化壓力敏感性及相關(guān)生理生化指標(biāo)的測定
        4.2.10 RT-PCR
        4.2.11 液泡、頂體及胞質(zhì)鈣的熒光顯微觀察
        4.2.12 小鼠系統(tǒng)性感染模型
        4.2.13 上皮細胞侵染模型
    第三節(jié) 結(jié)果與分析
        4.3.1 YVC1回補菌株及URA3原位回補菌株的構(gòu)建
        4.3.2 YVC1缺失對白念珠菌壓力敏感性的影響
        4.3.3 YVC1缺失對白念珠菌壓力刺激下鈣波動的影響
        4.3.4 YVC1缺失對白念珠菌形態(tài)發(fā)生能力的影響
        4.3.5 YVC1缺失對白念珠菌液泡、頂體及胞質(zhì)鈣分布的影響
        4.3.6 YVC1缺失對白念珠菌毒力的影響
    第四節(jié) 討論
        4.4.1 Yvc1在白念珠菌壓力應(yīng)答中的作用
        4.4.2 Yvc1在白念珠菌形態(tài)發(fā)生中的作用
        4.4.3 Yvc1在白念珠菌致病過程中的作用
        4.4.4 鈣信號系統(tǒng)介導(dǎo)白念珠菌形態(tài)發(fā)生及壓力應(yīng)答的相關(guān)機制
    第五節(jié) 小結(jié)
第五章 鈣通道阻斷劑對白念珠菌形態(tài)發(fā)生及壓力應(yīng)答的影響
    第一節(jié) 實驗材料
        5.1.1 菌株及引物
        5.1.2 主要儀器
        5.1.3 主要試劑
        5.1.4 培養(yǎng)基
    第二節(jié) 實驗方法
        5.2.1 堿性pH刺激下白念珠菌胞質(zhì)鈣濃度的測定
        5.2.2 藥物壓力下白念珠菌胞質(zhì)鈣及總鈣含量的測定
        5.2.3 β-半乳糖苷酶分析
        5.2.4 鈣通道阻斷劑對白念珠菌生長抑制效果的測定
        5.2.5 鈣通道阻斷劑與抗真菌藥物聯(lián)用對白念珠菌生長抑制效果的測定
        5.2.6 verapamil對白念珠菌菌絲發(fā)育抑制效果的測定
        5.2.7 verapamil對白念珠菌生物被膜抑制效果的測定
        5.2.8 verapamil與抗真菌藥物聯(lián)用對生物被膜形成抑制效果測定
        5.2.9 verapamil與抗真菌藥物聯(lián)用對生物被膜維持抑制效果測定
        5.2.10 RT-PCR
    第三節(jié) 結(jié)果與分析
        5.3.1 鈣通道阻斷劑對堿性刺激下胞質(zhì)鈣波動的影響
        5.3.2 鈣通道阻斷劑對藥物壓力下胞質(zhì)鈣及總鈣含量的影響
        5.3.3 鈣通道阻斷劑對白念珠菌正常生長的影響
        5.3.4 鈣通道阻斷劑對白念珠菌藥物耐受性的影響
        5.3.5 verapamil對白念珠菌菌絲發(fā)育的影響
        5.3.6 verapamil對白念珠菌生物被膜發(fā)育的影響
        5.3.7 verapamil對白念珠菌形態(tài)發(fā)生相關(guān)基因表達的影響
    第四節(jié) 討論
        5.4.1 鈣通道阻斷劑對白念珠菌鈣內(nèi)流的抑制作用
        5.4.2 鈣通道阻斷劑對白念珠菌藥物壓力應(yīng)答的影響
        5.4.3 鈣通道阻斷劑對白念珠菌形態(tài)發(fā)生的影響
    第五節(jié) 小結(jié)
第六章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 主要創(chuàng)新點
    6.3 相關(guān)工作的前景展望
參考文獻
致謝
附錄
個人簡歷及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3288444