對人類危害巨大的季節(jié)性流感主要由H1N1和H3N2亞型流感病毒引起,兩種亞型病毒常合并在一起感染流行；另一方面,近年來在不同地區(qū)爆發(fā)禽流感主要由H5N1和H9N2亞型感染引起,并正在跨越種族界限,從禽類直接感染人,引起極高的死亡率。由于各種亞型流感病毒所致疾病的治療和防控策略不同,建立可以同時進行H1、H3、H5、H9四種亞型病毒檢測和分型的快速檢測方法,對于流感的早期診斷和制定有效防治策略有重要意義。本論文圍繞H1、H3、H5、H9四種亞型流感病毒同步快速檢測和分型方法的建立,以及兩株H5N1亞型禽流感病毒地方分離株的生物學特性開展研究,取得了以下成果：1.采用SPF雞胚擴增了H1N1、H3N2、H5N1和H9N2四種亞型流感病毒,測定了四種亞型流感病毒的EIDso和血凝效價,計算了病毒的滴度。2.從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載了H1、H3、H5、H9以及M基因的序列,用CLUSTALX軟件比對分析,找出各亞型的保守序列,優(yōu)化設(shè)計了適合四種亞型病毒HA基因和A型流感病毒M基因同步擴增的多重RT-PCR檢測引物。通過摸索與優(yōu)化實驗條件,建立了A型流感病毒H1、H3、H5、H9亞型同步檢測分型的... 

【文章來源】：武漢大學湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

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中文摘要
Abstract
第一章 流感病毒病原生物學與流感防治技術(shù)綜述
    1.1 流感病毒一般特性
    1.2 A型流感病毒的基因組結(jié)構(gòu)以及編碼蛋白
    1.3 A型流感病毒的感染和復制
    1.4 流感流行病學
    1.5 流感病毒的抗原變異
    1.6 流感疫苗
        1.6.1 滅活疫苗
        1.6.2 減毒活疫苗
        1.6.3 亞單位基因工程疫苗
        1.6.4 DNA疫苗
        1.6.5 基因重組活載體疫苗
    1.7 抗流感藥物
        1.7.1 作用于神經(jīng)氨酸酶藥物
        1.7.2 作用于M2離子通道蛋白的藥物
        1.7.3 作用于病毒其它蛋白的藥物
        1.7.4 作用于宿主的藥物
    1.8 流感檢測技術(shù)
        1.8.1 病原學檢測
        1.8.2 血清學檢測
        1.8.3 分子生物學檢測
    1.9 流感的多重RT-PCR檢測技術(shù)國內(nèi)外研究進展
    1.10 本論文的目的和意義
第二章 A型流感病毒H1、H3、H5、H9亞型病毒核酸同步快速檢測和分型的多重RT-PCR方法建立
    2.1 材料
        2.1.1 A型流感病毒毒株與雞胚
        2.1.2 主要儀器設(shè)備和分子生物學軟件
        2.1.3 主要試劑與耗材
    2.2 方法
        2.2.1 流感病毒雞胚擴增
        2.2.2 病毒血凝效價測定
        2.2.3 病毒EID_(50)(50% Egg Infection Dose)測定
        2.2.4 引物設(shè)計與優(yōu)化
        2.2.5 病毒RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
        2.2.6 cDNA片段的單模板RT-PCR擴增
        2.2.7 cDNA片段的多模板RT-PCR擴增
        2.2.8 標準品質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.9 PCR檢測病毒RNA的靈敏度
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 克隆質(zhì)粒分子量,濃度及最終拷貝數(shù)的換算結(jié)果
        2.3.2 各亞型HA效價結(jié)果
        2.3.3 各亞型EID50結(jié)果
        2.3.4 引物設(shè)計和PCR反應(yīng)條件
        2.3.5 單模板的四重引物特異性分析
        2.3.6 多模板的四重引物特異性分析
        2.3.7 單模板的五重引物特異性分析
        2.3.8 多模板的五重引物特異性分析
        2.3.9 單模板的五重引物特異性分析(加入H7)
        2.3.10 多模板的五重引物特異性分析(加入H7)
        2.3.11 H1、H3、H5、H9亞型流感病毒多重RT-PCR靈敏度
        2.3.12 樣品檢測
    2.4 討論
第三章 H5N1禽流感病毒地方株的分離和特性研究
    3.1 材料
        3.1.1 主要試劑與耗材
        3.1.2 主要儀器設(shè)備和分子生物學軟件
    3.2 方法
        3.2.1 樣品采集過程
        3.2.2 細胞培養(yǎng)過程中用到的玻璃器皿的處理方法
        3.2.3 細胞培養(yǎng)室和超凈工作臺的消毒
        3.2.4 細胞培養(yǎng)與病毒的克隆與純化
        3.2.5 細胞的凍存與復蘇
        3.2.6 序列的生物信息學分析
        3.2.7 2株病毒人工感染Balb/c小鼠的致病性特性研究
        3.2.8 病毒在小鼠肺組織中滴度測定
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 2株禽流感病毒H5N1地方株的分離鑒定
        3.3.2 2株禽流感病毒H5N1地方株的HA和NA的核苷酸測序結(jié)果
        3.3.3 2株禽流感病毒H5N1地方株的BLAST比對分析的結(jié)果
        3.3.4 2株禽流感病毒H5N1地方株的HA基因系統(tǒng)進化樹分析的結(jié)果
        3.3.5 2株禽流感病毒H5N1地方株的NA基因系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果
        3.3.6 2株禽流感病毒H5N1地方株HA蛋白氨基酸同源性
        3.3.7 2株禽流感病毒H5N1地方株NA蛋白氨基酸同源性
        3.3.8 2株禽流感病毒感染小鼠的致病性結(jié)果
    3.4 討論
研究總結(jié)
參考文獻
博士在讀期間發(fā)表的論文
致謝
附錄


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3287286