本文關(guān)鍵詞：重組HER2胞外段的表達(dá)及其卵黃抗體的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人表皮生長(zhǎng)因子受體2（Human epidermal growth factor receptor2，HER2）的表達(dá)水平與一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān),其中約25%的乳腺癌患者HER2表達(dá)水平明顯升高，因此，研制靶向HER2的抗體等制劑可以用于乳腺癌等腫瘤的診斷。 卵黃抗體是從禽蛋中提取出來的IgY，相當(dāng)于哺乳動(dòng)物的與IgG。與IgG相比，IgY具有如下優(yōu)點(diǎn)：1）不與哺乳動(dòng)物Fc受體結(jié)合；2）不與G蛋白、A蛋白及類風(fēng)濕因子結(jié)合；3）不激活補(bǔ)體。當(dāng)用作診斷試劑時(shí)，IgY可以有效降低反應(yīng)體系中的背景值及假陽性，顯示出獨(dú)有的應(yīng)用空間。 本課題的目的是利用基因工程重組人HER2胞外段蛋白（rHER2-ECD），通過免疫蛋雞分別制備rHER2-ECD特異性血清抗體和卵黃抗體，為卵黃抗體的制備搭建實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。首先，我們將編碼HER2-ECD的基因克隆入pET-28a質(zhì)粒載體，并用IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)rHER2-ECD，經(jīng)SDS-PAGE電泳及Tanon軟件分析HER2-ECD的表達(dá)量不足10%，且以包涵體形式表達(dá)。然后，我們選擇昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，通過克隆-亞克隆方法構(gòu)建了含有重組HER2-ECD基因的桿狀病毒，，為后續(xù)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)rHER2-ECD奠定了基礎(chǔ)。為了嘗試制備卵黃抗體，我們利用鎳親和層析法從大腸桿菌中將誘導(dǎo)表達(dá)的rHER2-ECD純化出來，經(jīng)初步電泳及Western blot鑒定后，用rHER2-ECD免疫蛋雞，收取蛋雞的血清和雞蛋，從蛋黃中提取卵黃抗體，以間接ELISA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：卵黃抗體持續(xù)時(shí)間比血清抗體長(zhǎng)；卵黃抗體能在體外識(shí)別高表達(dá)HER2的腫瘤細(xì)胞。我們的結(jié)果提示，真核基因在大腸桿菌中表達(dá)水平低可能與密碼子偏愛性有關(guān)，卵黃抗體的制備可以成為廉價(jià)、高水平制備檢測(cè)抗體的有效技術(shù)平臺(tái)。
【關(guān)鍵詞】：人表皮生長(zhǎng)因子受體-2 細(xì)胞外段 卵黃抗體 大腸桿菌 桿狀病毒
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392;R737.9
【目錄】：

• 提要4-5
• 中文摘要5-8
• ABSTRACT8-15
• 第1章 前言15-33
• 1.1 人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（HER2）簡(jiǎn)介15-23
• 1.1.1 HER2 的生理功能及作用機(jī)制15-17
• 1.1.2 HER2 與腫瘤17-19
• 1.1.3 靶向 HER2 的腫瘤治療研究19-23
• 1.2 卵黃抗體簡(jiǎn)介23-29
• 1.2.1 卵黃抗體的特點(diǎn)23-24
• 1.2.2 卵黃抗體的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)24-27
• 1.2.3 卵黃抗體的應(yīng)用現(xiàn)狀27-29
• 1.2.4 IgY 在應(yīng)用上的局限性29
• 1.3 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（BVES）簡(jiǎn)介29-33
• 1.3.1 BVES 及其原理簡(jiǎn)介29-31
• 1.3.2 BVES 的優(yōu)點(diǎn)31-33
• 第2章 材料與方法33-51
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器33-35
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑33
• 2.1.2 引物合成及測(cè)序由上海生物工程有限公司完成33
• 2.1.3 菌種及質(zhì)粒33
• 2.1.4 培養(yǎng)基配制33-34
• 2.1.5 細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：34
• 2.1.6 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備34-35
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法35-51
• 2.2.1 HER2-ECD 在大腸桿菌中的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定35-43
• 2.2.2 rHER2-ECD 特異性卵黃抗體的制備43-46
• 2.2.3 HER2-ECD 在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（BVES）中的表達(dá)46-51
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-71
• 3.1 rHER2-ECD 在大腸桿菌中的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定51-58
• 3.1.1 HER2-ECD 基因的獲取、T-A 克隆的構(gòu)建及其鑒定51-52
• 3.1.2 HER2-ECD 基因亞克隆至 PET-28a 表達(dá)載體及其鑒定52-53
• 3.1.3 rHER2-ECD 的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定53-58
• 3.2 抗 rHER2-ECD 卵黃抗體的制備58-63
• 3.2.1 rHER2-ECD 免疫蛋雞58-59
• 3.2.2 間接 ELISA 方法檢測(cè)雞 H/雞 B 血清及卵黃中特異性抗體的產(chǎn)生59-60
• 3.2.3 卵黃抗體滴度檢測(cè)60-61
• 3.2.4 Western Blot 檢測(cè) IgY-HER2 是否可識(shí)別腫瘤細(xì)胞中的HER261-63
• 3.3 HER2-ECD 在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)63-71
• 3.3.1 HER2-ECD 基因的獲取及 T-A 克隆的構(gòu)建63-64
• 3.3.2 HER2-ECD 基因亞克隆至轉(zhuǎn)移載體 pFastBacTM1 中及其鑒定64-65
• 3.3.3 pFastBacTM1-HER2-ECD 轉(zhuǎn)化 DH10Bac 及重組子的篩選65-66
• 3.3.4 重組 Bacmid-HER2-ECD 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Sf-9 昆蟲細(xì)胞66-69
• 3.3.5 SDS-PAGE 分析 rHER2-ECD 的表達(dá)情況69-71
• 第4章 討論71-79
• 4.1 rHER2-ECD 在大腸桿菌表達(dá)量低的原因的探討71-72
• 4.2 純化的 rHER22-ECD 混有雜蛋白的原因分析72-73
• 4.3 蛋白免疫蛋雞后產(chǎn)生的卵黃抗體滴度不高的原因分析73-74
• 4.4 Western blot 檢測(cè) rHER2-ECD 特異性卵黃抗體對(duì)高表達(dá)HER2 的乳腺癌細(xì)胞的識(shí)別作用時(shí)，結(jié)果呈多條帶顯色的原因分析74-75
• 4.5 卵黃和血清中的特異性 IgY 的比較75-76
• 4.6 rHER2-ECD 在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)失敗的原因分析76-79
• 結(jié)論79-81
• 參考文獻(xiàn)81-89
• 攻讀學(xué)位期間取得的科研成果89-91
• 致謝91-93

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 劉孝榮;賀智敏;楊芳;余艷輝;呂輝;周敏;陳主初;;人HER2胞外區(qū)基因重組及重組蛋白的純化[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2006年01期

2 許銀輝;郭曉芳;鄔仙華;錢晨旭;羅磊;徐蓮花;馮紫雅;張小影;;HER2胞外段的克隆與原核表達(dá)[J];生物技術(shù)通報(bào);2012年08期

  本文關(guān)鍵詞：重組HER2胞外段的表達(dá)及其卵黃抗體的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：327533