發(fā)布時間：2017-04-26 02:10

  本文關鍵詞：重組HER2胞外段的表達及其卵黃抗體的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人表皮生長因子受體2（Human epidermal growth factor receptor2，HER2）的表達水平與一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關,其中約25%的乳腺癌患者HER2表達水平明顯升高，因此，研制靶向HER2的抗體等制劑可以用于乳腺癌等腫瘤的診斷。 卵黃抗體是從禽蛋中提取出來的IgY，相當于哺乳動物的與IgG。與IgG相比，IgY具有如下優(yōu)點：1）不與哺乳動物Fc受體結合；2）不與G蛋白、A蛋白及類風濕因子結合；3）不激活補體。當用作診斷試劑時，IgY可以有效降低反應體系中的背景值及假陽性，顯示出獨有的應用空間。 本課題的目的是利用基因工程重組人HER2胞外段蛋白（rHER2-ECD），通過免疫蛋雞分別制備rHER2-ECD特異性血清抗體和卵黃抗體，為卵黃抗體的制備搭建實驗平臺。首先，我們將編碼HER2-ECD的基因克隆入pET-28a質粒載體，并用IPTG誘導大腸桿菌BL21(DE3)表達rHER2-ECD，經SDS-PAGE電泳及Tanon軟件分析HER2-ECD的表達量不足10%，且以包涵體形式表達。然后，我們選擇昆蟲表達系統(tǒng)，通過克隆-亞克隆方法構建了含有重組HER2-ECD基因的桿狀病毒，，為后續(xù)在昆蟲細胞中表達rHER2-ECD奠定了基礎。為了嘗試制備卵黃抗體，我們利用鎳親和層析法從大腸桿菌中將誘導表達的rHER2-ECD純化出來，經初步電泳及Western blot鑒定后，用rHER2-ECD免疫蛋雞，收取蛋雞的血清和雞蛋，從蛋黃中提取卵黃抗體，以間接ELISA進行檢測。結果顯示：卵黃抗體持續(xù)時間比血清抗體長；卵黃抗體能在體外識別高表達HER2的腫瘤細胞。我們的結果提示，真核基因在大腸桿菌中表達水平低可能與密碼子偏愛性有關，卵黃抗體的制備可以成為廉價、高水平制備檢測抗體的有效技術平臺。
【關鍵詞】：人表皮生長因子受體-2 細胞外段 卵黃抗體 大腸桿菌 桿狀病毒
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392;R737.9
【目錄】：

• 提要4-5
• 中文摘要5-8
• ABSTRACT8-15
• 第1章 前言15-33
• 1.1 人表皮生長因子受體-2（HER2）簡介15-23
• 1.1.1 HER2 的生理功能及作用機制15-17
• 1.1.2 HER2 與腫瘤17-19
• 1.1.3 靶向 HER2 的腫瘤治療研究19-23
• 1.2 卵黃抗體簡介23-29
• 1.2.1 卵黃抗體的特點23-24
• 1.2.2 卵黃抗體的應用優(yōu)勢24-27
• 1.2.3 卵黃抗體的應用現(xiàn)狀27-29
• 1.2.4 IgY 在應用上的局限性29
• 1.3 桿狀病毒表達系統(tǒng)（BVES）簡介29-33
• 1.3.1 BVES 及其原理簡介29-31
• 1.3.2 BVES 的優(yōu)點31-33
• 第2章 材料與方法33-51
• 2.1 實驗材料與儀器33-35
• 2.1.1 實驗試劑33
• 2.1.2 引物合成及測序由上海生物工程有限公司完成33
• 2.1.3 菌種及質粒33
• 2.1.4 培養(yǎng)基配制33-34
• 2.1.5 細胞株和實驗動物：34
• 2.1.6 主要實驗設備34-35
• 2.2 實驗方法35-51
• 2.2.1 HER2-ECD 在大腸桿菌中的構建、表達及鑒定35-43
• 2.2.2 rHER2-ECD 特異性卵黃抗體的制備43-46
• 2.2.3 HER2-ECD 在桿狀病毒表達系統(tǒng)（BVES）中的表達46-51
• 第3章 實驗結果51-71
• 3.1 rHER2-ECD 在大腸桿菌中的構建、表達及鑒定51-58
• 3.1.1 HER2-ECD 基因的獲取、T-A 克隆的構建及其鑒定51-52
• 3.1.2 HER2-ECD 基因亞克隆至 PET-28a 表達載體及其鑒定52-53
• 3.1.3 rHER2-ECD 的誘導表達及鑒定53-58
• 3.2 抗 rHER2-ECD 卵黃抗體的制備58-63
• 3.2.1 rHER2-ECD 免疫蛋雞58-59
• 3.2.2 間接 ELISA 方法檢測雞 H/雞 B 血清及卵黃中特異性抗體的產生59-60
• 3.2.3 卵黃抗體滴度檢測60-61
• 3.2.4 Western Blot 檢測 IgY-HER2 是否可識別腫瘤細胞中的HER261-63
• 3.3 HER2-ECD 在桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達63-71
• 3.3.1 HER2-ECD 基因的獲取及 T-A 克隆的構建63-64
• 3.3.2 HER2-ECD 基因亞克隆至轉移載體 pFastBacTM1 中及其鑒定64-65
• 3.3.3 pFastBacTM1-HER2-ECD 轉化 DH10Bac 及重組子的篩選65-66
• 3.3.4 重組 Bacmid-HER2-ECD 質粒轉染 Sf-9 昆蟲細胞66-69
• 3.3.5 SDS-PAGE 分析 rHER2-ECD 的表達情況69-71
• 第4章 討論71-79
• 4.1 rHER2-ECD 在大腸桿菌表達量低的原因的探討71-72
• 4.2 純化的 rHER22-ECD 混有雜蛋白的原因分析72-73
• 4.3 蛋白免疫蛋雞后產生的卵黃抗體滴度不高的原因分析73-74
• 4.4 Western blot 檢測 rHER2-ECD 特異性卵黃抗體對高表達HER2 的乳腺癌細胞的識別作用時，結果呈多條帶顯色的原因分析74-75
• 4.5 卵黃和血清中的特異性 IgY 的比較75-76
• 4.6 rHER2-ECD 在桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達失敗的原因分析76-79
• 結論79-81
• 參考文獻81-89
• 攻讀學位期間取得的科研成果89-91
• 致謝91-93

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 劉孝榮;賀智敏;楊芳;余艷輝;呂輝;周敏;陳主初;;人HER2胞外區(qū)基因重組及重組蛋白的純化[J];生物醫(yī)學工程學雜志;2006年01期

2 許銀輝;郭曉芳;鄔仙華;錢晨旭;羅磊;徐蓮花;馮紫雅;張小影;;HER2胞外段的克隆與原核表達[J];生物技術通報;2012年08期

  本文關鍵詞：重組HER2胞外段的表達及其卵黃抗體的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：327533