本文關(guān)鍵詞：鈣離子及水解酶在HIV-1 Vpu對宿主限制因子Tetherin拮抗過程中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Tetherin（BST2，，CD317）是一類天然宿主限制因子，可由干擾素α誘導表達。Tetherin具有廣譜的抗病毒功能，能夠抑制多種包膜病毒從宿主細胞中釋放，而此功能依賴于其特定的拓撲和空間結(jié)構(gòu)。Tetherin是一種II型膜蛋白，其整體結(jié)構(gòu)由N端胞漿區(qū)（CT）、單次穿膜螺旋區(qū)（TM）、胞外螺旋區(qū)，C端糖基磷脂酰肌醇（glycosyl-phosphatidyl inositol，GPI）錨定區(qū)構(gòu)成。為了拮抗Tetherin對病毒釋放的束縛作用， HIV-1通過編碼Vpu蛋白幫助新生病毒粒子順利脫逃。Vpu是HIV-1特有的I型膜蛋白，包含一段較短的胞外區(qū)，一段由α單股螺旋穿膜區(qū)，一段雙股α螺旋胞內(nèi)區(qū)。HIV-1Vpu對宿主限制因子Tetherin的拮抗作用對于HIV-1新生病毒粒子的順利出芽和釋放十分重要，但其通過何種機制拮抗Tetherin的作用尚不明確。這幾年國際上對此問題的報道是逐步深化的，開始主要集中在Vpu對Tetherin的降解作用，隨后進展為對Tetherin細胞表面定位的下調(diào)作用，但進一步的研究表明這二者都不是最主要的作用，Vpu對Tetherin的拮抗機制仍有待進一步闡明。 Vpu的同源寡聚體能夠形成弱選擇性鉀離子通道，同時也有報道其可能干擾細胞的背景鉀離子通道TASK的功能，但這類通道活性是否在促進釋放和拮抗Tetherin方面具有作用仍不明確。Vpu具有離子通道活性，暗示其對細胞的膜電位以及胞內(nèi)外的某些重要離子（如鈣離子）的平衡可能有潛在影響。而Tetherin的物理系留作用使得我們和其他研究者們猜想Vpu可能通過激活某種形式的水解酶的活力來對Tetherin進行切割從而促進病毒釋放。本論文在以上三個方面做了初步的探索性研究，為該研究領(lǐng)域提供了新思路。 本論文首先探究了Vpu的存在是否影響細胞內(nèi)鈣離子的濃度以及這種變化是否與Vpu自身的離子通道活性相關(guān)。我們在瞬時轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Vpu的細胞中利用鈣熒光探針Fluo-4AM標記細胞內(nèi)的鈣離子，通過流式細胞術(shù)和倒置熒光顯微鏡鏡檢兩種手段均檢測到Vpu對細胞內(nèi)鈣離子濃度具有上調(diào)作用。 其次，本論文研究了細胞內(nèi)鈣濃度的變化是否會影響Vpu對Tetherin的拮抗作用，以及這一過程中是否有電壓依賴鈣離子通道的參與。熒光定量PCR結(jié)果顯示，293T細胞和Hela細胞均能夠內(nèi)源性表達L型鈣離子通道和T型鈣離子通道相關(guān)亞基。利用RNA干擾和使用拮抗劑阻斷鈣通道等方法檢測了VDCC對病毒釋放的影響，結(jié)果表明，Vpu對Tetherin的拮抗作用可能與T型VDCC相關(guān)。此外，通過流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)VDCC并不參與Vpu對細胞表面Tetherin表達量的下調(diào)過程。這些實驗結(jié)果暗示Vpu可能通過T型VDCC調(diào)控細胞內(nèi)鈣離子濃度，而鈣離子可能通過某些需要進一步研究的其他機制，如阻止Tetherin定位于病毒出芽位點或者激活某些水解酶類的方式，來拮抗Tetherin的功能。 此外，本論文探討了一些可能作用于Tetherin的水解酶是否參與Vpu拮抗Tetherin過程。通過添加不同水解酶抑制劑的方法檢測各類水解酶對HIV-1病毒釋放的影響，證實了Vpu對Tetherin的拮抗作用與磷脂酶C、磷脂酶D和MMP不具有直接相關(guān)性，但MMP可能促進HIV-1病毒釋放。我們還發(fā)現(xiàn)Tetherin存在潛在的弗林蛋白酶作用位點，但通過對該位點進行點突變，觀察到Tetherin突變體的蛋白條帶沒有發(fā)生遷移現(xiàn)象，我們基本排除了弗林蛋白酶作用于Tetherin的可能性。 通過以上實驗，我們對這些可能參與Vpu拮抗Tetherin過程的調(diào)控分子進行了嘗試性摸索。這些實驗結(jié)果幫助我們對Vpu與Tetherin的相互作用機制有了更深入的了解，為我們今后的探索方向提供一定的借鑒。在未來我們將設(shè)計更精細的實驗深入研究Vpu引起的胞漿鈣濃度的提升是否能夠調(diào)控Vpu對Tetherin的拮抗過程，以及T型VDCC在這個過程中所發(fā)揮的作用。此外，初步探究Vpu對Tetherin的拮抗作用是否與膜曲率變化相關(guān)。通過這些探索性實驗，嘗試發(fā)現(xiàn)鈣離子與Vpu/Tetherin作用途徑的潛在關(guān)聯(lián)并揭示一條新的依賴鈣離子的Vpu對Tetherin的拮抗途徑。
【關(guān)鍵詞】：HIV-1 Tetherin Vpu 拮抗作用 鈣離子 VDCC 水解酶 膜曲率
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第一章 前言13-29
• 1.1 宿主限制因子 Tetherin 的研究現(xiàn)狀13-16
• 1.1.1 Tetherin 的結(jié)構(gòu)13-14
• 1.1.2 Tetherin 的抗病毒機制14-16
• 1.2 HIV-1 Vpu 的研究現(xiàn)狀16-19
• 1.2.1 HIV-1 簡介16-17
• 1.2.2 Vpu 的結(jié)構(gòu)與離子通道活性17-18
• 1.2.3 Vpu 對 Tetherin 拮抗作用18-19
• 1.3 HIV-1 病毒釋放過程相關(guān)調(diào)控因素的研究現(xiàn)狀19-23
• 1.3.1 鈣離子對 HIV-1 病毒釋放的調(diào)控作用19-20
• 1.3.2 細胞膜去極化與 HIV-1 病毒釋放20-23
• 1.3.2.1 Vpu 引起的細胞膜去極化與其促病毒釋放的關(guān)系20-21
• 1.3.2.2 電壓依賴鈣離子通道簡介21-23
• 1.3.2.3 電壓依賴鈣離子通道在免疫細胞中的表達23
• 1.4 幾類可能作用于 Tetherin 的水解酶簡介23-26
• 1.4.1 磷脂酶23-25
• 1.4.1.1 磷脂酶簡介23
• 1.4.1.2 GPI 錨定蛋白與磷脂酶23-24
• 1.4.1.3 磷脂酶作用于 Tetherin 的可行性的相關(guān)研究現(xiàn)狀24-25
• 1.4.2 基質(zhì)金屬蛋白酶25
• 1.4.2.1 基質(zhì)金屬蛋白酶簡介25
• 1.4.2.2 Tetherin 與基質(zhì)金屬蛋白酶的相互作用25
• 1.4.3 弗林蛋白酶（Furin）25-26
• 1.5 論文設(shè)計與實驗方案26-29
• 1.5.1 論文目的26-27
• 1.5.2 實驗設(shè)計27-29
• 1.5.2.1 Vpu 的離子通道活性對細胞內(nèi)鈣濃度的影響27
• 1.5.2.2 細胞內(nèi)鈣濃度對 Vpu 拮抗 Tetherin 功能的影響27-28
• 1.5.2.3 水解酶對 Vpu 拮抗 Tetherin 功能的影響28-29
• 第二章 實驗材料和方法29-40
• 2.1 材料與試劑29-31
• 2.2 主要儀器31-32
• 2.3 實驗方法32-40
• 2.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建32-34
• 2.3.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染34
• 2.3.3 蛋白電泳與免疫印跡34-35
• 2.3.4 穩(wěn)定表達細胞系的構(gòu)建35
• 2.3.5 細胞周期同步化35-36
• 2.3.6 細胞內(nèi)游離鈣離子濃度測定36
• 2.3.7 流式細胞術(shù)36-37
• 2.3.8 病毒的收集及含量測定37
• 2.3.9 RNA 干擾及效果評價37-40
• 2.3.9.1 siRNA 的合成與轉(zhuǎn)染37-38
• 2.3.9.2 細胞總 RNA 的提取38
• 2.3.9.3 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA38
• 2.3.9.4 熒光定量 PCR38-40
• 第三章 實驗結(jié)果40-65
• 3.1 Vpu 的離子通道活性對細胞內(nèi)鈣濃度的影響40-47
• 3.1.1 Vpu 及 Vpu 突變體的 RFP 融合表達載體的構(gòu)建40-42
• 3.1.2 驗證 Vpu 對細胞內(nèi)鈣濃度的影響42-45
• 3.1.3 驗證 Vpu 對細胞鈣濃度的上調(diào)與 Vpu 自身離子通道的相關(guān)性45-46
• 3.1.4 在穩(wěn)定表達 Vpu 的 293T 細胞系中驗證 Vpu 對細胞鈣濃度的上調(diào)現(xiàn)象46-47
• 3.2 細胞內(nèi)鈣濃度對 Vpu 拮抗 Tetherin 功能的影響47-59
• 3.2.1 廣譜型鈣通道拮抗劑 CdCl2對病毒釋放的影響48-50
• 3.2.2 T 型 VDCC 對 Vpu 拮抗 Tetherin 功能的影響50-54
• 3.2.2.1 T 型 VDCC 的亞基α1G，α1H 在 293T、Hela 細胞中的內(nèi)源表達檢測50-51
• 3.2.2.2 T 型 VDCC 拮抗劑 Ethosuximide 對病毒釋放的影響51
• 3.2.2.3 沉默 T 型 VDCC 表達后檢測病毒釋放變化51-53
• 3.2.2.4 T 型 VDCC 拮抗劑 Ethosuximide 對細胞表面 Tetherin 表達量的影響53-54
• 3.2.3 L 型 VDCC 對 Vpu 拮抗 Tetherin 功能的影響54-59
• 3.2.3.1 L 型 VDCC 的亞基α1C，α1D 在 293T、Hela 細胞中的內(nèi)源表達檢測54-55
• 3.2.3.2 L 型 VDCC 拮抗劑 Nifedipine 對病毒釋放的影響55-56
• 3.2.3.3 沉默 L 型 VDCC 表達后檢測病毒釋放變化56-58
• 3.2.3.4 L 型 VDCC 拮抗劑 Nifedipine 對細胞表面 Tetherin 表達量的影響58-59
• 3.3 水解酶對 Vpu 拮抗 Tetherin 功能的影響59-65
• 3.3.1 磷脂酶 C 對 Vpu 拮抗 Tetherin 功能的影響59-61
• 3.3.2 磷脂酶 D 對 Vpu 拮抗 Tetherin 功能的影響61-62
• 3.3.3 MMP 對 Vpu 拮抗 Tetherin 功能的影響62-63
• 3.3.4 驗證 Tetherin 的潛在弗林蛋白酶切割位點的可行性63-65
• 第四章 討論65-68
• 結(jié)論68-69
• 參考文獻69-75
• 作者簡介75
• 在學期間主要科研成果75-76
• 致謝76

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