【目的】在無動物源性的干細胞培養(yǎng)體系中建立植入前遺傳學檢測（PGT）胚胎來源的人胚胎干細胞系,為醫(yī)學研究提供疾病模型�！痉椒ā吭谖覀兊难芯恐�,對無動物源性的人類包皮成纖維細胞飼養(yǎng)層（XF-HFF）與成分確定的培養(yǎng)基（CDM）構(gòu)建的無動物源性培養(yǎng)體系進行了評估。在該培養(yǎng)體系中,利用染色體平衡易位患者PGT來源的廢棄胚胎建立一個新的人胚干細胞（hESC）細胞系�！窘Y(jié)果】新建立的人胚胎干細胞系在無動物源性培養(yǎng)系統(tǒng)中可長期培養(yǎng)傳代（>45個代次）。核型分析顯示,在傳代45代次后,新建立的人胚胎干細胞仍保持一致的核型。XF-HFF/CDM中的hESC仍保持多能性。通過熒光免疫染色檢測到SSEA-3、SSEA-4、SSEA-1、TRA-1-60、TRA-1-81等多能標志物的表達;RT-PCR分析顯示,在XF-HFF/CDM培養(yǎng)體系上生長的hESC中存在干細胞標記。小鼠體內(nèi)實驗也證實了hESC在體內(nèi)維持其多能性�！窘Y(jié)論】本研究建立了PGT來源的人胚胎干細胞系,為進一步建立攜帶遺傳疾病基因的hESC系并為臨床研究和治療提供疾病模型打下了基礎。 

【文章來源】：中山大學學報(醫(yī)學版). 2019,40(04)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

XF/HFF-CDM培養(yǎng)體系中hESC的干細胞標志物表達Fig.2ExpressionofstemcellmarkersinhESCgrowninXF-HFF/CDMCDA：SSEA-3；B：SSEA-4；C：Tra-1-60；D：Tra-1-81.SSEA：stage-specificembryonicantigen；Tra：tumorrejectionantigen.Thescalebarrepresents50μm.

???7~10d的懸浮培養(yǎng)，觀察到有類胚體的形成。收集類胚體，加Trizol處理后用于RT-PCR檢測到分化相關(guān)基因REX-1、SOX-2、LIN28、NPM1和GDF3基因的表達（圖3），證實新建立的hESC系在體外具有分化的能力。2.4形態(tài)學結(jié)果提示分化潛能將AF-hESC注入嚴重免疫缺陷（SCID）小鼠體內(nèi)能形成畸胎瘤，包括了來源于外、中、內(nèi)3個胚層的組織：皮脂腺、肌纖維和腸上皮等（圖4）。這表明AF-hESC具有多向分化潛能。2.5染色體核型結(jié)果對建立的干細胞系進行核型鑒定為46，XY，圖3hESC多能性因子的表達Fig.3ExpressionofstemcellmarkersA：ectoderm：sebaceousgland；B：endoderm：musclefiber；C：mesoderm：intestinalepithelium（×20）圖4在XF-HFF/CDM培養(yǎng)體系中新建立的hESC系的體內(nèi)分化實驗Fig.4InvivoanalysisofthepluripotencyofhESCculturedinXF-HFF/CDMABCt（1；20）（p13.3；q13.1；圖5）。分別對第15、20、25、30代次和解凍后第36代的hESC進行了5次核型鑒定，均為同一異常核型。3討論hESC建系及培養(yǎng)過程中，外源性成分主要來源于這幾個方面：①飼養(yǎng)層細胞或無飼養(yǎng)層基質(zhì)的動物性成分，或者暴露于含動物蛋白的培養(yǎng)基中；②hESC培養(yǎng)基中添加的動物蛋白血清，如FBS和SR；③常用于去除滋養(yǎng)層細胞獲得ICM的免疫外科法也會使胚胎接觸動物蛋白。一直以來，研究者們就致力于優(yōu)化hESC的培養(yǎng)體系，消除培養(yǎng)體系中的動物源性成分，以期獲得完全無動物源性的hESC培養(yǎng)體系和hESC系。圖5在XF-HFF/CDM培養(yǎng)體系中新建立的hESC系?

（POU5F1）（圖3）。為進一步檢測干細胞系的分化能力，我們將hESC在無飼養(yǎng)層的低粘附皿中用20%FBS-DMEM培養(yǎng)基經(jīng)過7~10d的懸浮培養(yǎng)，觀察到有類胚體的形成。收集類胚體，加Trizol處理后用于RT-PCR檢測到分化相關(guān)基因REX-1、SOX-2、LIN28、NPM1和GDF3基因的表達（圖3），證實新建立的hESC系在體外具有分化的能力。2.4形態(tài)學結(jié)果提示分化潛能將AF-hESC注入嚴重免疫缺陷（SCID）小鼠體內(nèi)能形成畸胎瘤，包括了來源于外、中、內(nèi)3個胚層的組織：皮脂腺、肌纖維和腸上皮等（圖4）。這表明AF-hESC具有多向分化潛能。2.5染色體核型結(jié)果對建立的干細胞系進行核型鑒定為46，XY，圖3hESC多能性因子的表達Fig.3ExpressionofstemcellmarkersA：ectoderm：sebaceousgland；B：endoderm：musclefiber；C：mesoderm：intestinalepithelium（×20）圖4在XF-HFF/CDM培養(yǎng)體系中新建立的hESC系的體內(nèi)分化實驗Fig.4InvivoanalysisofthepluripotencyofhESCculturedinXF-HFF/CDMABCt（1；20）（p13.3；q13.1；圖5）。分別對第15、20、25、30代次和解凍后第36代的hESC進行了5次核型鑒定，均為同一異常核型。3討論hESC建系及培養(yǎng)過程中，外源性成分主要來源于這幾個方面：①飼養(yǎng)層細胞或無飼養(yǎng)層基質(zhì)的動物性成分，或者暴露于含動物蛋白的培養(yǎng)基中；②hESC培養(yǎng)基中添加的動物蛋白血清，如FBS和SR；③常用于去除滋養(yǎng)層細胞獲得ICM的免疫外科法也會使胚胎接觸動物蛋白。一直以來，研究者們就致力于優(yōu)化hESC的培養(yǎng)體系，消除培養(yǎng)體系中的動物?

【參考文獻】：
期刊論文
[1]無動物源性成分人胚胎干細胞培養(yǎng)體系與其它人胚胎干細胞培養(yǎng)體系的比較[J]. 張丹,麥慶云,李濤,徐艷文,丁晨輝,宏蘋蘋,曾艷紅,周燦權(quán).  中山大學學報(醫(yī)學科學版). 2012(06)



本文編號：3266469