發(fā)布時間：2017-04-24 18:05

  本文關(guān)鍵詞：急性酒精性脂肪肝斑馬魚模型的建立及異甘草酸鎂保肝作用機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的 酗酒是當(dāng)前社會的熱點問題,無論是短期內(nèi)大量酒精攝入還是長期慢性酒精依賴都會導(dǎo)致嚴(yán)重的肝臟損害。酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver, AFL)是過量酒精攝入后最常見且最早出現(xiàn)的肝損害形式,可進(jìn)展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化甚至肝癌。有調(diào)查研究指出,長期酗酒者中90%以上可以發(fā)展成為脂肪肝,其中20%-40%的酒精性脂肪肝患者可發(fā)展為肝纖維化,8%-20%可發(fā)展為肝硬化,3%-10%的患者可最終發(fā)展為肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)。在我國,酒精已成為繼病毒性肝炎后導(dǎo)致肝臟損傷的第二大病因,酒精性肝病是嚴(yán)重影響我國人民生命健康的公共衛(wèi)生問題。 然而目前,酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制尚未明確,臨床上缺少有效的靶向治療手段。為深入研究其發(fā)病機(jī)制,開發(fā)出更多有效的防治藥物,需要建立一種簡單易行而又經(jīng)濟(jì)實用的動物模型。目前,國內(nèi)外傳統(tǒng)的酒精性脂肪肝模型常以嚙齒類動物作為實驗對象,主要采用灌胃或腹腔注射酒精的方法,平均實驗周期約為1-16周。與嚙齒類動物相比,斑馬魚具有飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)、方便；發(fā)育迅速,產(chǎn)卵量多,容易獲得足夠的樣本量；體外受精,胚胎透明,便于顯微鏡下觀察肝臟；體積小,適合大規(guī)模飼養(yǎng),有利于高通量藥物篩選等獨(dú)特優(yōu)點,很好地解決了嚙齒類動物模型操作復(fù)雜、樣本量局限、實驗耗費(fèi)相對較高且周期較長的問題。與此同時,有研究指出,斑馬魚體內(nèi)擁有代謝酒精所需的關(guān)鍵酶,肝臟在胚胎發(fā)育的第四天便開始成熟,乙醇可以直接加入水中,是進(jìn)行酒精性肝病研究和相關(guān)藥物篩選的理想模式生物。然而,目前國內(nèi)對酒精性脂肪肝的基礎(chǔ)研究仍以嚙齒類動物為主,尚未有酒精性脂肪肝斑馬魚模型的報道。 異甘草酸鎂(Magnesium isoglucyrrhizinate, MgIG)通名異甘草酸鎂注射液,為傳統(tǒng)中藥甘草中的單一立體異構(gòu)體。MgIG作為第四代甘草酸類制劑,具有更強(qiáng)的抗炎、保護(hù)肝細(xì)胞膜及改善肝功能的作用。臨床上主要用于慢性病毒性肝炎病人的治療,能夠有效改善肝炎病人的肝功能狀態(tài)。近年來大量基礎(chǔ)研究也表明,MgIG對各種化學(xué)性、藥物性肝損害和非酒精性脂肪肝等具有保護(hù)作用。另外,其在酒精性肝病中的作用也逐漸明確,但對于酒精性脂肪肝的防治研究報道甚少,且其具體作用機(jī)制也尚不明確。 本研究基于以上研究背景,利用斑馬魚獨(dú)特的生理結(jié)構(gòu)優(yōu)勢,以其作為模式生物,采用直接將乙醇加入斑馬魚培養(yǎng)用水中的方式,通過觀察不同濃度乙醇處理后斑馬魚一般生存率和表型變化,整體油紅染色觀察肝臟形態(tài)、肝內(nèi)脂滴沉積情況并評判脂肪肝發(fā)生率,石蠟切片觀察斑馬魚肝組織病理變化,Real-time RT-PCR檢測脂質(zhì)代謝途徑相關(guān)基因表達(dá),選取最佳乙醇濃度和處理時間點在國內(nèi)首次建立一種簡單易行、重復(fù)性好的急性酒精性脂肪肝斑馬魚模型。在此模型基礎(chǔ)上,給予高、中、低三個濃度異甘草酸鎂干預(yù)后,通過觀察斑馬魚肝臟形態(tài)、脂肪肝發(fā)生率及肝臟病理等關(guān)鍵指標(biāo),評估異甘草酸鎂對急性酒精性脂肪肝是否具有保護(hù)作用。最后,從脂質(zhì)代謝方面初步探討異甘草酸鎂的防治機(jī)理。以期為酒精性脂肪肝防治藥物的開發(fā)和相關(guān)機(jī)制研究開拓新的思路。 研究內(nèi)容 一.方法 1、實驗動物 野生型AB品系斑馬魚由南方醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物教研室斑馬魚實驗室提供。按照Westerfield方法對斑馬魚進(jìn)行養(yǎng)殖。光照周期維持L:D=14h:10h,溫度維持在28.5℃。雌雄成魚自然交配,收集受精卵于盛有幼魚孵化液的平皿中,置于恒溫孵箱中28.5℃孵育。 2、酒精處理 受精卵發(fā)育到5dpf,挑選肝臟發(fā)育正常的幼魚分別給予斑馬魚0%、2.0%、2.5%和3.0%乙醇處理直至32h。為防止乙醇揮發(fā),加蓋后用Parafilm封條封閉。 3、斑馬魚整體油紅染色 收集處理后的斑馬魚于染色皿中,4%多聚甲醛固定過夜,PBS洗滌2次,丙二醇從低濃度到高濃度滲透,0.5%油紅避光孵育過夜。同樣濃度丙二醇從高濃度到低濃度洗凈背景,80%丙二醇4℃冰箱保存。每組隨機(jī)挑選20條,Olympus szx10體式顯微鏡下觀察肝臟脂肪變性情況并進(jìn)行拍照,記錄脂肪肝發(fā)生率。 4、病理組織切片 4%多聚甲醛固定斑馬魚過夜,不同濃度酒精脫水,二甲苯透明,浸蠟后包埋,4μm切片,行蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色,Olympus BX51光鏡下觀察肝臟病理變化。 5、Real-time RT-PCR 收集處理后的斑馬魚置于1.5ml EP管中,每組約36條。迅速加入Trizol,按照步驟提取總RNA。RNA濃度、純度通過紫外分光光度法(Nanodrop, Thermo Fisher Scientific, USA)測定。利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (TAKARA)試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實時定量聚合酶連鎖反應(yīng)采用Applied Bio systems7500Real-Time PCR System進(jìn)行檢測。 6、統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組間比較采用兩個獨(dú)立樣本t檢驗。組間兩兩比較用LSD檢驗。作圖用Sigmaplot10.0軟件。P0.05有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。 二.結(jié)果 第一章急性酒精性脂肪肝斑馬魚模型的建立 1、乙醇對斑馬魚生存率的影響 乙醇處理后24h,隨著乙醇濃度增高,斑馬魚生存率逐漸降低。乙醇處理后32h后各組生存率差異顯著。2.0%、2.5%和3.0%乙醇處理組斑馬魚32h內(nèi)生存率分別為100%、(91.21±1.61)%、0%。 2、乙醇對斑馬魚表型和活動度的影響 乙醇處理后24h,2.0%乙醇處理組斑馬魚形態(tài)基本正常,觀察其活動度增加,游動異常,表現(xiàn)為轉(zhuǎn)圈、竄動。3.0%乙醇處理斑馬魚全部靜止不動,出現(xiàn)表型變化,表現(xiàn)為：脊柱彎曲,心包水腫,體腔出血,卵黃囊水腫,魚鰾未形成。2.5%乙醇處理組斑馬魚中部分出現(xiàn)以上表型變化。 3、乙醇對斑馬魚肝臟形態(tài)的影響 整體油紅染色結(jié)果顯示：與對照組相比,2.0%乙醇處理組斑馬魚在處理32h后肝臟明顯腫大。 4、乙醇導(dǎo)致斑馬魚肝內(nèi)大量脂滴沉積 整體油紅染色后分離對照組和2.0%乙醇處理組斑馬魚肝臟組織,2.0%乙醇處理組斑馬魚肝臟組織染色明顯加深,肝內(nèi)有點狀脂滴沉積,嚴(yán)重的脂滴布滿全肝。 5、乙醇對斑馬魚脂肪肝發(fā)生率的影響 整體油紅染色結(jié)果顯示：2.0%乙醇處理組斑馬魚在處理32h后脂肪肝發(fā)生率顯著高于對照組((71.25±0.15)%對比(31.25±0.05)%,戶5.102,P=0.002),而24h時,兩組脂肪肝發(fā)生率無統(tǒng)計學(xué)差異((17.50±0.15)%對比(7.50±0.05)%,t=1.265,P=0.253)。 6、乙醇對斑馬魚肝臟組織病理的影響 光鏡下觀察肝臟組織病理改變,對照組斑馬魚肝組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)正常,2.0%乙醇處理32h后斑馬魚肝細(xì)胞腫脹、肝內(nèi)脂滴沉積增多、脂肪肝形成。 7、乙醇對斑馬魚脂質(zhì)代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)水平的影響 乙醇處理24h時,脂質(zhì)代謝相關(guān)基因accl, fasn, hmgcs和hmgcra mRNA在2.0%乙醇處理組中的表達(dá)量分別為對照組的(2.9401±0.4845)、(2.8733±0.7876)、(6.5050±4.8122)和(3.1762±1.3638)倍,表達(dá)水平明顯增高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。32h時,2.0%乙醇處理組中accl, fasn, hmgcs和hmgcra mRNA表達(dá)量分別為對照組的(4.4459±1.1233)、(3.7219±0.9065)、(4.1729±1.1271)和(3.9238±0.8222)倍,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 第二章異甘草酸鎂對斑馬魚急性酒精性脂肪肝的藥效觀察 1、異甘草酸鎂對AFL斑馬魚肝臟形態(tài)的影響 整體油紅染色結(jié)果顯示：與對照組相比,模型組斑馬魚肝臟明顯腫大,肝內(nèi)染色加深,有點狀脂滴沉積；單純給予MgIG (0.1mg/ml),斑馬魚肝臟形態(tài)正常；造模同時給予MgIG (0.1mg/ml)干預(yù),干預(yù)組斑馬魚肝臟腫脹程度較模型組相比有所減輕。 2、異甘草酸鎂對AFL斑馬魚脂肪肝發(fā)生率的影響 整體油紅染色結(jié)果顯示：與對照組相比,模型組脂肪肝發(fā)生率顯著升高((63.33±0.06)%對比(36.67±0.08)%,P=0.002)；與模型組相比,中濃度MgIG (0.1mg/ml)干預(yù)組斑馬魚脂肪肝發(fā)生率顯著下降((37.33±0.11)%對比(63.33±0.06)%,P=0.022)。而高濃度MgIG(1mg/ml)和低濃度MgIG(0.01mg/ml)干預(yù)后,斑馬魚脂肪肝發(fā)生率較模型組相比無統(tǒng)計學(xué)差異((65.00±0.15)%對比(63.33±0.06)%,P=0.861；(68.33±0.12)%對比(63.33±0.06)%,P=0.602)。由此可見,在造模同時給予MgIG (0.1mg/ml)干預(yù)可以有效降低斑馬魚脂肪肝發(fā)生率,高濃度組MgIG和低濃度組MgIG均不能發(fā)揮其保護(hù)作用。 3、異甘草酸鎂對AFL斑馬魚肝臟組織病理的影響 光鏡下觀察肝臟病理組織改變情況,HE染色結(jié)果顯示：對照組斑馬魚肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,無脂質(zhì)空泡；模型組斑馬魚肝組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)異常,肝細(xì)胞腫脹,可見彌漫性的脂質(zhì)空泡,胞漿內(nèi)擠滿了微小脂泡；單純給予MgIG (0.1mg/ml),斑馬魚肝組織結(jié)構(gòu)正常；與模型組相比,造模同時給予MgIG (0.1mg/ml)干預(yù)后肝內(nèi)無彌漫性脂質(zhì)空泡形成,肝組織脂肪變性情況有所改善。 第三章異甘草酸鎂保肝作用機(jī)制的初步探討 1、異甘草酸鎂對脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶accl, fasn, hmgcs和hmgcra mRNA表達(dá)量的影響 Real-time RT-PCR實驗結(jié)果顯示：與對照組相比,模型組accl, fasn, hmgcs和hmgcra mRNA表達(dá)量分別為對照組的(3.6372±1.4115),(3.3860±0.8487),(2.7270±1.3024)和(2.6209±2.1109)倍,表達(dá)水平顯著升高,統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P0.05); MgIG (0.1mg/ml)干預(yù)組accl, fasn, hmgcs和hmgcra mRNA表達(dá)量分別為對照組的(0.4581±0.2532),(0.4905±0.3100),(1.7604±0.7372)和(1.2578±0.2471)倍�？梢�,與模型組相比,造模同時給予MgIG (0.1mg/ml)干預(yù)后能夠顯著下調(diào)accl, fasn, hmgcs和hmgcra mRNA的表達(dá)量,統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P0.05)。 2、異甘草酸鎂對echs, mpt mRNA表達(dá)量的影響 Real-time RT-PCR實驗結(jié)果顯示：①echs mRNA表達(dá)水平在對照組、模型組、MgIG給藥組和MgIG干預(yù)組之間差異不大。模型組echs mRNA表達(dá)量為對照組的(0.7757±±0.0608)倍,表達(dá)水平有所下降。兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.102)；MgIG (0.1mg/ml)干預(yù)組echs mRNA表達(dá)量為對照組的(0.8734±±0.2879)倍。MgIG (0.1mg/ml)干預(yù)組echs mRNA表達(dá)量與模型組相比亦無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.445)。②模型組mpt mRNA表達(dá)量為對照組的(1.6899±0.4790)倍,表達(dá)水平顯著升高。兩組之間具有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.018); MgIG (0.1mg/ml)干預(yù)組mpt mRNA表達(dá)量為對照組的(0.6236±±0.0573)倍�？梢�,與模型組相比,造模同時給予MgIG (0.1mg/ml)干預(yù)能夠下調(diào)mpt mRNA表達(dá)水平,兩組間差異顯著(P=0.002)。 三.結(jié)論 1、本研究通過直接在養(yǎng)魚水中加入乙醇的方法成功地建立急性酒精性脂肪肝斑馬魚模型。其最佳濃度和時間點為2.0%乙醇處理32h。此模型為進(jìn)一步開展藥效評估、藥物篩選和機(jī)制研究奠定了實驗基礎(chǔ)。 2、MgIG (0.1mg/ml)對急性酒精性脂肪肝具有保護(hù)作用,MgIG (1mg/ml)和MgIG (0.01mg/ml)均不能發(fā)揮其保護(hù)作用。MgIG可能通過對脂質(zhì)代謝過程中關(guān)鍵基因的調(diào)節(jié)、糾正脂質(zhì)代謝紊亂從而達(dá)到對肝臟的保護(hù)作用。 3、斑馬魚是活體研究肝臟疾病、進(jìn)行藥物篩選的有效臨床前模式生物,我們的研究為臨床應(yīng)用MgIG治療酒精性肝病患者提供實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：斑馬魚脂肪肝 酒精性模型 動物
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R575.5;R-332
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-26
• 參考文獻(xiàn)22-26
• 第一章 急性酒精性脂肪肝斑馬魚模型的建立26-47
• 1 材料和方法27-35
• 2 結(jié)果35-41
• 3 討論41-44
• 4 參考文獻(xiàn)44-47
• 第二章 異甘草酸鎂對斑馬魚急性酒精性脂肪肝的藥效觀察47-55
• 1 材料和方法47-49
• 2 結(jié)果49-51
• 3 討論51-53
• 4 參考文獻(xiàn)53-55
• 第三章 異甘草酸鎂保肝作用機(jī)制的初步探討55-64
• 1 材料和方法55-58
• 2 結(jié)果58-60
• 3 討論60-62
• 4 參考文獻(xiàn)62-64
• 全文總結(jié)64-65
• 綜述65-76
• 參考文獻(xiàn)72-76
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果76-77
• 致謝77-79

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 王輝,王江濱;肝炎病毒感染與酒精性肝硬化關(guān)系的研究(附182例酒精性肝病臨床病例報告)[J];白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1998年06期

2 黃順玲,戴水奇,張雪紅,喻友軍,譚妹蓮,易長庚;湖南省酒精性肝病流行病學(xué)調(diào)查概況[J];中國醫(yī)師雜志;2005年03期

3 陳士林;孟曉丹;王炳元;向國卿;;遼寧省部分城市酒精性肝病流行現(xiàn)狀調(diào)查[J];實用肝臟病雜志;2010年06期

4 劉陽,遲寶榮;酒精性肝硬化237例臨床分析[J];吉林醫(yī)學(xué);2004年04期

5 經(jīng)小珍;劉競;錢海;;異甘草酸鎂治療大鼠非酒精性脂肪性肝炎及其作用機(jī)制[J];臨床肝膽病雜志;2011年03期

6 夏國棟;周賢;鄧明明;呂沐瀚;李波;;異甘草酸鎂注射液對大鼠梗阻性黃疸肝損傷的保護(hù)作用[J];現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué);2011年07期

7 陳詠萍;姜錫平;常慶華;陶艷;;異甘草酸鎂治療藥物性肝損害[J];臨床薈萃;2012年22期

  本文關(guān)鍵詞：急性酒精性脂肪肝斑馬魚模型的建立及異甘草酸鎂保肝作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：324680