本文關鍵詞：小類泛素化修飾在肺炎支原體感染中作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的轉錄因子NF-kB廣泛存在于哺乳動物細胞內,它可以調節(jié)細胞因子、趨化因子、生長因子、粘附分子、免疫受體基因的表達,影響機體內的細胞分化、免疫反應、炎癥反應、細胞凋亡、腫瘤生長等多種生物學功能。NF-kB是由p65和p50組成的異源二聚體,細胞處于靜息狀態(tài)時,NF-kB二聚體通過非共價鍵形成與ikB結合于細胞質中呈無生物活性。但是ikB可以被泛素化修飾,泛素化修飾后的ikB將會在26S蛋白酶的作用降解,從而釋放NF-kB,使其入核從而進行相關的基因轉錄。 肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae, Mp)作為一種常見的人源致病性支原體,其全球感染呈上升趨勢。報道顯示亞洲12個醫(yī)學中心1756例社區(qū)獲得性肺炎患者的非典型微生物流行狀況,Mp感染率達己達22.4%。其感染除了引起原發(fā)型非典勝肺炎、咽炎、氣管炎、支氣管炎等呼吸道疾病以外,還可引起全身各系統(tǒng)的合并癥,因此清除這一病原體極其困難。細胞內定位、免疫調節(jié)效應和表面抗原變異都可能導致支原體感染發(fā)生。因此對于肺炎支原體的致病機理以及宿主免疫系統(tǒng)抵抗感染的機制已經成為現(xiàn)今研究的熱點之一 小類泛素化修飾肽(small ubiquitin-like modifier, SUMO)于20世紀末被發(fā)現(xiàn),廣泛存在于真核生物中,是高度保守的蛋白家族。小類泛素化修飾(SUMOylation, SUMO化修飾)是一種已經被廣泛認知的細胞內的重要調控方式,它參與細胞的多種生理生化反應,而調節(jié)該過程的酶是維持修飾系統(tǒng)精確表達的重要保障。最新的研究顯示,SUMO化修飾在單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)感染宿主的過程中起著重要的作用。SUMO化反應與泛素化反應相反,它可以抑制NF-κB的功能,主要是通過SUMO與泛素競爭iKB第373位的賴氨酸殘基來實現(xiàn)的。這樣就可以阻斷ikB的泛素化,從而抑制NF-κB的功能。 本論文旨在揭示SUMO化修飾在Mp感染過程中的作用,為Mp致病機制的研究提供新方向和新思路。 方法 1.應用Real time PCR方法檢測人單核細胞株THP-1對Mp的清除作用； 2.應用細胞計數(shù)法和LDH法檢測Mp體外對THP-1生長的影響； 3.應用PI染色法檢測THP-1細胞凋亡情況； 4.應用western blot法和免疫共沉淀法測定Mp作用后單核細胞THP-1內源性結合型SUMO、iκB及SUMO-iκB復合體的表達變化； 5. ELISA試劑盒檢測細胞因子TNF-α。 結果 1.108CCU/ml Mp刺激THP-1細胞24hr內Mp隨著作用時間增長,DNA濃度呈現(xiàn)降低趨勢,感染4hr和24hr Mp DNA減少數(shù)值具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。隨著作用時間延長,Mp DNA濃度出現(xiàn)升高趨勢； 2.107CCU/ml Mp和108CCU/ml Mp分別感染THP-1細胞24hr后,細胞計數(shù)結果表明,隨著Mp刺激濃度的增加,細胞減少增多,結果具有顯著性差異； 3.乳酸脫氫酶(LDH)結果顯示,107CCU/ml Mp和108CCU/ml Mp感染THP-1細胞24hr,48hr和72hr后,細胞上清中所含LDH量均增高,和正常細胞相比,Mp感染的THP-1細胞膜均有破損,LDH通過破損細胞膜進入細胞培養(yǎng)液中,結果具有顯著性差異(P0.05)； 4.PI染色法檢測細胞凋亡結果顯示107CCU/ml Mp刺激THP-124hr,48hr后G2/M期細胞數(shù)量明顯增多,S期細胞數(shù)量下降,細胞凋亡明顯； 5.Mp感染THP-1細胞0hr,8hr,24hr,48hr后,western blotting結果顯示,細胞內結合型SUMO表達量呈增加趨勢；iKB表達量也呈增加趨勢；Co-IP結果顯示,SUMO-iκB結合體表達量明顯增加。 結論 通過我們的實驗證明,Mp可能主要是通過兩個途徑來逃避單核細胞株THP-1的清除作用的： 1.Mp可以誘導人單核細胞株THP-1的凋亡來逃避免疫系統(tǒng)的清除； 2.Mp可以通過提高ikB的小類泛素化修飾水平抑制NF-kB信號通路的活化,進而來逃避免疫系統(tǒng)的清除作用。 本實驗證明Mp能夠促進THP-1的凋亡,同時提高細胞中iKB的小類泛素化修飾水平進而抑制NF-kB通路,使Mp能夠順利逃避機體免疫系統(tǒng),免于被機體清除,從而致病。
【關鍵詞】：肺炎支原體 iκB 凋亡 小類泛素化修飾 THP-1
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R375.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號說明10-11
• 前言11-16
• 研究現(xiàn)狀、成果11-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、高濃度Mp誘導THP-1細胞凋亡16-26
• 1.1 對象和方法16-21
• 1.1.1 研究對象16-17
• 1.1.2 試劑與儀器17
• 1.1.3 方法17-21
• 1.1.3.1 CCU法測定Mp濃度17
• 1.1.3.2 Mp感染THP-1細胞17-18
• 1.1.3.3 Mp RNA的提取18
• 1.1.3.4 Real time PCR反應18-19
• 1.1.3.5 顯微鏡下細胞計數(shù)19-20
• 1.1.3.6 LDH法測細胞活性20
• 1.1.3.7 PI染色法檢測細胞凋亡20-21
• 1.1.4 統(tǒng)計學處理21
• 1.2 結果21-24
• 1.3 討論24-25
• 1.4 小結25-26
• 二、Mp改變THP-1細胞中iκB的小類泛素化修飾水平26-37
• 2.1 對象和方法26-32
• 2.1.1 研究對象26-27
• 2.1.2 試劑與儀器27
• 2.1.3 方法27-32
• 2.1.3.1 細胞總蛋白提取27
• 2.1.3.2 Western blotting實驗27-30
• 2.1.3.3 免疫共沉淀30-31
• 2.1.3.4 ELISA檢測TNF-α31-32
• 2.1.3.5 蛋白定量軟件分析32
• 2.1.4 統(tǒng)計學處理32
• 2.2 結果32-35
• 2.3 討論35-36
• 2.4 小結36-37
• 結論37-38
• 參考文獻38-42
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明42-43
• 附錄43-44
• 綜述 肺炎支原體與哮喘及其致病機制44-59
• 綜述參考文獻55-59
• 致謝59

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