本文關(guān)鍵詞：小類泛素化修飾在肺炎支原體感染中作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的轉(zhuǎn)錄因子NF-kB廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、粘附分子、免疫受體基因的表達(dá),影響機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞分化、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、腫瘤生長(zhǎng)等多種生物學(xué)功能。NF-kB是由p65和p50組成的異源二聚體,細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí),NF-kB二聚體通過(guò)非共價(jià)鍵形成與ikB結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)中呈無(wú)生物活性。但是ikB可以被泛素化修飾,泛素化修飾后的ikB將會(huì)在26S蛋白酶的作用降解,從而釋放NF-kB,使其入核從而進(jìn)行相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。 肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae, Mp)作為一種常見(jiàn)的人源致病性支原體,其全球感染呈上升趨勢(shì)。報(bào)道顯示亞洲12個(gè)醫(yī)學(xué)中心1756例社區(qū)獲得性肺炎患者的非典型微生物流行狀況,Mp感染率達(dá)己達(dá)22.4%。其感染除了引起原發(fā)型非典勝肺炎、咽炎、氣管炎、支氣管炎等呼吸道疾病以外,還可引起全身各系統(tǒng)的合并癥,因此清除這一病原體極其困難。細(xì)胞內(nèi)定位、免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)和表面抗原變異都可能導(dǎo)致支原體感染發(fā)生。因此對(duì)于肺炎支原體的致病機(jī)理以及宿主免疫系統(tǒng)抵抗感染的機(jī)制已經(jīng)成為現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)之一 小類泛素化修飾肽(small ubiquitin-like modifier, SUMO)于20世紀(jì)末被發(fā)現(xiàn),廣泛存在于真核生物中,是高度保守的蛋白家族。小類泛素化修飾(SUMOylation, SUMO化修飾)是一種已經(jīng)被廣泛認(rèn)知的細(xì)胞內(nèi)的重要調(diào)控方式,它參與細(xì)胞的多種生理生化反應(yīng),而調(diào)節(jié)該過(guò)程的酶是維持修飾系統(tǒng)精確表達(dá)的重要保障。最新的研究顯示,SUMO化修飾在單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)感染宿主的過(guò)程中起著重要的作用。SUMO化反應(yīng)與泛素化反應(yīng)相反,它可以抑制NF-κB的功能,主要是通過(guò)SUMO與泛素競(jìng)爭(zhēng)iKB第373位的賴氨酸殘基來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這樣就可以阻斷ikB的泛素化,從而抑制NF-κB的功能。 本論文旨在揭示SUMO化修飾在Mp感染過(guò)程中的作用,為Mp致病機(jī)制的研究提供新方向和新思路。 方法 1.應(yīng)用Real time PCR方法檢測(cè)人單核細(xì)胞株THP-1對(duì)Mp的清除作用； 2.應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法和LDH法檢測(cè)Mp體外對(duì)THP-1生長(zhǎng)的影響； 3.應(yīng)用PI染色法檢測(cè)THP-1細(xì)胞凋亡情況； 4.應(yīng)用western blot法和免疫共沉淀法測(cè)定Mp作用后單核細(xì)胞THP-1內(nèi)源性結(jié)合型SUMO、iκB及SUMO-iκB復(fù)合體的表達(dá)變化； 5. ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α。 結(jié)果 1.108CCU/ml Mp刺激THP-1細(xì)胞24hr內(nèi)Mp隨著作用時(shí)間增長(zhǎng),DNA濃度呈現(xiàn)降低趨勢(shì),感染4hr和24hr Mp DNA減少數(shù)值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。隨著作用時(shí)間延長(zhǎng),Mp DNA濃度出現(xiàn)升高趨勢(shì)； 2.107CCU/ml Mp和108CCU/ml Mp分別感染THP-1細(xì)胞24hr后,細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明,隨著Mp刺激濃度的增加,細(xì)胞減少增多,結(jié)果具有顯著性差異； 3.乳酸脫氫酶(LDH)結(jié)果顯示,107CCU/ml Mp和108CCU/ml Mp感染THP-1細(xì)胞24hr,48hr和72hr后,細(xì)胞上清中所含LDH量均增高,和正常細(xì)胞相比,Mp感染的THP-1細(xì)胞膜均有破損,LDH通過(guò)破損細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)液中,結(jié)果具有顯著性差異(P0.05)； 4.PI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示107CCU/ml Mp刺激THP-124hr,48hr后G2/M期細(xì)胞數(shù)量明顯增多,S期細(xì)胞數(shù)量下降,細(xì)胞凋亡明顯； 5.Mp感染THP-1細(xì)胞0hr,8hr,24hr,48hr后,western blotting結(jié)果顯示,細(xì)胞內(nèi)結(jié)合型SUMO表達(dá)量呈增加趨勢(shì)；iKB表達(dá)量也呈增加趨勢(shì)；Co-IP結(jié)果顯示,SUMO-iκB結(jié)合體表達(dá)量明顯增加。 結(jié)論 通過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)證明,Mp可能主要是通過(guò)兩個(gè)途徑來(lái)逃避單核細(xì)胞株THP-1的清除作用的： 1.Mp可以誘導(dǎo)人單核細(xì)胞株THP-1的凋亡來(lái)逃避免疫系統(tǒng)的清除； 2.Mp可以通過(guò)提高ikB的小類泛素化修飾水平抑制NF-kB信號(hào)通路的活化,進(jìn)而來(lái)逃避免疫系統(tǒng)的清除作用。 本實(shí)驗(yàn)證明Mp能夠促進(jìn)THP-1的凋亡,同時(shí)提高細(xì)胞中iKB的小類泛素化修飾水平進(jìn)而抑制NF-kB通路,使Mp能夠順利逃避機(jī)體免疫系統(tǒng),免于被機(jī)體清除,從而致病。
【關(guān)鍵詞】：肺炎支原體 iκB 凋亡 小類泛素化修飾 THP-1
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R375.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明10-11
• 前言11-16
• 研究現(xiàn)狀、成果11-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、高濃度Mp誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡16-26
• 1.1 對(duì)象和方法16-21
• 1.1.1 研究對(duì)象16-17
• 1.1.2 試劑與儀器17
• 1.1.3 方法17-21
• 1.1.3.1 CCU法測(cè)定Mp濃度17
• 1.1.3.2 Mp感染THP-1細(xì)胞17-18
• 1.1.3.3 Mp RNA的提取18
• 1.1.3.4 Real time PCR反應(yīng)18-19
• 1.1.3.5 顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)19-20
• 1.1.3.6 LDH法測(cè)細(xì)胞活性20
• 1.1.3.7 PI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡20-21
• 1.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理21
• 1.2 結(jié)果21-24
• 1.3 討論24-25
• 1.4 小結(jié)25-26
• 二、Mp改變THP-1細(xì)胞中iκB的小類泛素化修飾水平26-37
• 2.1 對(duì)象和方法26-32
• 2.1.1 研究對(duì)象26-27
• 2.1.2 試劑與儀器27
• 2.1.3 方法27-32
• 2.1.3.1 細(xì)胞總蛋白提取27
• 2.1.3.2 Western blotting實(shí)驗(yàn)27-30
• 2.1.3.3 免疫共沉淀30-31
• 2.1.3.4 ELISA檢測(cè)TNF-α31-32
• 2.1.3.5 蛋白定量軟件分析32
• 2.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理32
• 2.2 結(jié)果32-35
• 2.3 討論35-36
• 2.4 小結(jié)36-37
• 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-42
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明42-43
• 附錄43-44
• 綜述 肺炎支原體與哮喘及其致病機(jī)制44-59
• 綜述參考文獻(xiàn)55-59
• 致謝59

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本文編號(hào)：324227