MicroRNA（miRNA）是真核生物中位于非編碼區(qū)的一類(lèi)小RNA,他們?cè)诟鞣N疾病和生理過(guò)程中起著非常重要的作用。其中miR-130a/b對(duì)白血病、脂肪生成等重要生理過(guò)程具有調(diào)控作用。然而,miR-130a/b的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及其在代謝和炎癥方面的功能目前還遠(yuǎn)未研究清楚。本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、基因定點(diǎn)突變、染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）、熒光定量PCR、小鼠腹腔注射等實(shí)驗(yàn)技術(shù),對(duì)miR-130a/b的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究。我們發(fā)現(xiàn)C/EBPa可直接作用于miR-130a/b的啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性。取得的主要結(jié)果如下：1、克隆了小鼠miR-130a/b的啟動(dòng)子序列,并將它們構(gòu)建于PGL3-Basic載體中。在BHK21細(xì)胞系中驗(yàn)證其啟動(dòng)子活性；2、通過(guò)熒光活性分析證實(shí)了C/EBPa對(duì)miR-130a的啟動(dòng)子活性具有顯著的抑制作用,而對(duì)于miR-130b的啟動(dòng)子活性有顯著性的上調(diào)；3、突變和ChIP實(shí)驗(yàn)確定了C/EBPa對(duì)miR-130a/b的關(guān)鍵作用位點(diǎn)和二者的直接相互結(jié)合；4、功能研究上,驗(yàn)證了miR-130a/b對(duì)3T3-L1細(xì)胞在成脂分化雌中的表達(dá)量顯著下降,在穩(wěn)... 

【文章來(lái)源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：62 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表
1 前言
    1.1 MiRNA
    1.2 MiRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與生物加工
    1.3 MiRNA的作用機(jī)制
        1.3.1 翻譯起始抑制
        1.3.2 翻譯起始后抑制
        1.3.3 介導(dǎo)mRNA衰減
        1.3.4 正調(diào)控和去抑制
    1.4 MiRNA與疾病
        1.4.1 MiRNA與炎癥
        1.4.2 MiRNA與脂肪分化
    1.5 研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒
    2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2.2 主要溶液的配置
        2.2.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.4 分子生物學(xué)相關(guān)軟件
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 細(xì)胞基因組DNA的制備
        2.3.2 小鼠miR-130a/b啟動(dòng)子序列擴(kuò)增及雙熒光真核報(bào)告表達(dá)載體構(gòu)建
        2.3.3 DNA電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物及回收純化
        2.3.4 DNA片段的克隆與測(cè)序
        2.3.5 質(zhì)粒的大量提取
        2.3.6 細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        2.3.7 細(xì)胞總RNA提取、純化和反轉(zhuǎn)錄
        2.3.8 實(shí)時(shí)定量PCR
    2.4 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)
        2.4.1 試劑準(zhǔn)備
        2.4.2 細(xì)胞裂解
        2.4.3 被動(dòng)裂解
        2.4.4 檢測(cè)樣品
    2.5 染色質(zhì)免疫共沉淀
    2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 miR-130a/b對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞成脂分化的影響
    3.2 小鼠miR-130a/b對(duì)SP1和TNF α表達(dá)的影響
    3.3 LPS處理對(duì)小鼠miR-130a/b的表達(dá)影響
    3.4 小鼠miR-130a/b啟動(dòng)子克隆與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)
    3.5 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)小鼠miR-130a/b啟動(dòng)子活性影響
    3.6 小鼠miR-130a/b啟動(dòng)子全長(zhǎng)及截短活性分析
    3.7 C/EBP α對(duì)小鼠miR-130a/b啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)
    3.8 MiR-130a/b啟動(dòng)子上受C/EBP α調(diào)節(jié)的關(guān)鍵位點(diǎn)分析
    3.9 C/EBP α與miR-130a/b啟動(dòng)子的特異性結(jié)合
    3.10 BHK21細(xì)胞中C/EBPα對(duì)miR-130a和miR-130b的表達(dá)量影響
4 討論
5 結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn)
    5.1 結(jié)論
    5.2 創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]miRNA*生物合成及其功能研究的新發(fā)現(xiàn)[J]. 馬圣運(yùn),白玉,韓凝,王君暉,翁曉燕,邊紅武,朱睦元.  遺傳. 2012(04)



本文編號(hào)：3207200