發(fā)布時間：2021-05-09 02:03

　　本論文通過基因工程的方法，把源于天然蛇毒的去整合素dendroaspin中的一段含RGD（Arg-Gly-Asp）功能序列的13肽（CFTPRGDMPGPYC）基因及改變此13肽兩端的兩個半胱氨酸為兩個絲氨酸的13肽（SFTPRGDMPGPYS）基因分別插入到突變的無活性人胰島素原[A6-A11Ser]-HPI分子的B27和A1位點之間的基因中，從而取代掉[A6-A11Ser]-HPI分子上的C肽基因，構(gòu)建成兩個能展示RGD功能序列的人源化胰島素基因，再通過分子克隆技術(shù)把這兩個基因連接到溫度誘導(dǎo)型表達載體質(zhì)粒pBV220上，在大腸桿菌DH5α中進行高效表達（表達產(chǎn)率約為13％）。表達產(chǎn)物以不溶的包含體形式存在，再經(jīng)超聲破菌、包含體裂解、等電點沉淀、二硫鍵還原重組、SephadexG-50分子篩層析及反相柱層析等一系列步驟最終獲得兩個突變體蛋白RGD-Cys-Ins和RGD-Ser-Ins，兩者的不同之處在于后者新插入的13肽上缺少了一對二硫鍵，使得RGD-Ser-Ins蛋白中的RGD功能序列及其周邊幾個氨基酸所構(gòu)成的局域構(gòu)象比RGD-Cys-Ins的更為松散靈活，缺乏剛性。對這兩個蛋白... 

【文章來源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：110 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮寫表
第一章 前言
    第一節(jié) 胰島素及胰島素基因工程研究概況
        一、胰島素研究概況
        二、胰島素基因工程研究概況
    第二節(jié) RGD肽及其整合素受體家族研究現(xiàn)狀
        一、RGD肽及其整合素受體家族
        二、RGD-多肽與抗血栓
        三、RGD-多肽與骨質(zhì)疏松
        四、RGD-多肽與腫瘤治療
    第三節(jié) 基因治療研究現(xiàn)狀
    第四節(jié) 本論文的立題依據(jù)及工作背景
        一、立題依據(jù)
        二、本實驗室相關(guān)的工作
        三、實驗的可行性
第二章 實驗材料、儀器及方法
    第一節(jié) 實驗材料、儀器
        一、實驗材料
        二、儀器設(shè)備
        三、常用溶液配方
    第二節(jié) 實驗方法
        一、常規(guī)的分子克隆技術(shù)
        二、目的蛋白的表達與分離純化
        三、表達產(chǎn)物的性質(zhì)測定
        四、生物活性測定
第三章 突變 RGD-Ins蛋白的結(jié)構(gòu)與活性研究
    第一節(jié) 突變 RGD-Ins基因的構(gòu)建
        一、空間結(jié)構(gòu)模擬分析結(jié)果
        二、突變基因的構(gòu)建
        三、目的基因的分析鑒定
    第二節(jié) RGD-Ins蛋白的分離、純化及活性分析
        一、RGD-Cys-Ins和 RGD-Ser-Ins的分離及純化
        二、RGD-Cys-Ins和 RGD-Ser-Ins的性質(zhì)分析
        三、RGD-Cys-Ins和 RGD-Ser-Ins的生物活性比較
    第三節(jié) 討論
第四章 pCMV-RGD-Ins基因治療及預(yù)防血栓研究
    第一節(jié) 含引導(dǎo)肽pCMV-RGD-Ins基因的構(gòu)建與制備
        一、pCMV-RGD-Ins基因的構(gòu)建
        二、pCMV-RGD-Ins基因的大量制備及酶切鑒定
    第二節(jié) pCMV-RGD-Ins基因體內(nèi)轉(zhuǎn)入及其表達的檢測
        一、pCMv-RGD-Ins基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)入
        二、pCMv-RGD-Ins基因在小鼠骨胳肌中表達的檢測
    第三節(jié) pCMV-RGD-Ins轉(zhuǎn)基因小鼠相關(guān)指標(biāo)的變化
        一、pCMV-RGD-Ins轉(zhuǎn)基因小鼠血清胰島素樣物質(zhì)濃度的變化
        二、pCMv-RGD-Ins轉(zhuǎn)基因小鼠出血時間的改變
        三、PCMv-RGD-Ins轉(zhuǎn)基因小鼠血糖濃度的變化
    第四節(jié) 討論
第五章 總結(jié)與展望
參考文獻
致謝
博士期間發(fā)表的論文目錄
附文一
附文二


【參考文獻】：
期刊論文
[1]抗凝活性肽RGD226基因構(gòu)建、表達、產(chǎn)物純化及活性分析[J]. 楊興文,劉儉,唐建國.  中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報. 2002(05)



本文編號：3176399