發(fā)布時間：2021-04-15 22:36

　　目的構(gòu)建帶Flag標(biāo)簽pcDNA3.0載體的沉默信息調(diào)節(jié)因子2（Sirt2）真核表達(dá)載體,驗證其表達(dá)蛋白與M2型丙酮酸激酶（PKM2）的相互結(jié)合。方法利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）從人乳腺文庫中擴增出人Sirt2的CDS編碼序列,將擴增出的Sirt2基因片段插入雙酶切后pcDNA3.0-Flag載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α后提取質(zhì)粒,驗證表達(dá),測序正確后,分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-Flag/myc-PKM2和Flag-Sirt2/myc-PKM2共轉(zhuǎn)染至人胚腎細(xì)胞（293T）,通過免疫共沉淀實驗證明Sirt2蛋白表與PKM2蛋白有相互結(jié)合。結(jié)果重組質(zhì)粒Flag-Sirt2的基因序列與目的序列完全一致,Western印跡檢測蛋白表達(dá)成功;免疫共沉淀實驗證實Sirt2蛋白與PKM2蛋白有相互結(jié)合。結(jié)論成功構(gòu)建了Flag-Sirt2真核表達(dá)載體,證實Sirt2蛋白與PKM2蛋白有相互結(jié)合,為進(jìn)一步研究Sirt2在糖酵解中發(fā)揮的功能提供了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：軍事醫(yī)學(xué). 2019,43(07)北大核心

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

PCR擴增人Sirt2基因

FFllaagg--SSiirrtt 2雙酶切電泳圖

293T細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-Flag與Flag-Sirt2質(zhì)粒24 h后，收集細(xì)胞行Western印跡檢測Sirt2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-Flag質(zhì)粒的樣品無特異性條帶；轉(zhuǎn)染Flag-Sirt2質(zhì)粒的樣品約在相對分子質(zhì)量43×103處可見特異性條帶（圖4）。2.3免疫共沉淀實驗驗證Sirt2蛋白與PKM2蛋白相互結(jié)合


本文編號：3140212