目的構(gòu)建帶Flag標(biāo)簽pcDNA3.0載體的沉默信息調(diào)節(jié)因子2（Sirt2）真核表達(dá)載體,驗(yàn)證其表達(dá)蛋白與M2型丙酮酸激酶（PKM2）的相互結(jié)合。方法利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）從人乳腺文庫(kù)中擴(kuò)增出人Sirt2的CDS編碼序列,將擴(kuò)增出的Sirt2基因片段插入雙酶切后pcDNA3.0-Flag載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α后提取質(zhì)粒,驗(yàn)證表達(dá),測(cè)序正確后,分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-Flag/myc-PKM2和Flag-Sirt2/myc-PKM2共轉(zhuǎn)染至人胚腎細(xì)胞（293T）,通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明Sirt2蛋白表與PKM2蛋白有相互結(jié)合。結(jié)果重組質(zhì)粒Flag-Sirt2的基因序列與目的序列完全一致,Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)成功;免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)Sirt2蛋白與PKM2蛋白有相互結(jié)合。結(jié)論成功構(gòu)建了Flag-Sirt2真核表達(dá)載體,證實(shí)Sirt2蛋白與PKM2蛋白有相互結(jié)合,為進(jìn)一步研究Sirt2在糖酵解中發(fā)揮的功能提供了基礎(chǔ)。 

【文章來(lái)源】：軍事醫(yī)學(xué). 2019,43(07)北大核心

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【部分圖文】：

PCR擴(kuò)增人Sirt2基因

FFllaagg--SSiirrtt 2雙酶切電泳圖

293T細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-Flag與Flag-Sirt2質(zhì)粒24 h后，收集細(xì)胞行Western印跡檢測(cè)Sirt2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-Flag質(zhì)粒的樣品無(wú)特異性條帶；轉(zhuǎn)染Flag-Sirt2質(zhì)粒的樣品約在相對(duì)分子質(zhì)量43×103處可見特異性條帶（圖4）。2.3免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Sirt2蛋白與PKM2蛋白相互結(jié)合


本文編號(hào)：3140212