本文關(guān)鍵詞：融合抗原PstS1-LEP原核表達(dá)及血清學(xué)診斷，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tb)引起的結(jié)核病死灰復(fù)燃,常規(guī)結(jié)核病化療對(duì)耐藥、耐多藥結(jié)核病治療效果降低。雖然結(jié)核病預(yù)防有卡介苗(BCG),治療有一線、二線抗結(jié)核化療藥物,然而全球結(jié)核病疫情仍十分嚴(yán)重,仍然是世界公共衛(wèi)生問(wèn)題。結(jié)核病控制包括診斷、治療、預(yù)防,隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展,不斷發(fā)現(xiàn)用于結(jié)核病診斷和疫苗研制的M.tb抗原及其衍生抗原。 目的：本研究通過(guò)大腸桿菌表達(dá)M.tb融合蛋白PstS1-LEP,并作為抗原,采用ELISA法檢測(cè)結(jié)核患者、肺外結(jié)核患者、肺部疾病患者以及健康人血清學(xué)抗PstS1-LEP IgG抗體,旨在評(píng)價(jià)新融合抗原用于結(jié)核病血清學(xué)診斷的價(jià)值。 方法：(1)利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)SYFPEITHI分析20個(gè)蛋白的抗原表位,篩選得分高12條Th表位肽,每條15個(gè)氨基酸,首尾相連組成一條多肽LEP,根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子設(shè)計(jì)編譯LEP的堿基序列,由上海生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行全基因合成(N端引入BamH I酶切位點(diǎn)和C端引入Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))。目的基因經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證正確后與pET-28a-pstsl載體相連,將重組質(zhì)粒pET-28a-pstsl-LEP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。融合蛋白PstS1-LEP經(jīng)DEAE陰離子親和層析純化并稀釋透析復(fù)性。蛋白免疫印跡法(western blotting)檢測(cè)復(fù)性的PstS1-LEP蛋白與結(jié)核病患者來(lái)源血清和抗PstS1單抗反應(yīng)；該蛋白作為抗原,采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)肺結(jié)核患者、肺外結(jié)核患者、肺部疾病患者和入伍新兵來(lái)源的血清IgG抗體,旨在評(píng)價(jià)該蛋白在血清學(xué)診斷方面的價(jià)值。 結(jié)果：人工合成了LEP蛋白編碼基因,該基因克隆到PET-28a-PstS1載體,重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定,正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行全基因測(cè)序表明與LEP編碼堿基序列一致。重組PstS1-LEP蛋白在大腸桿菌中獲得表達(dá),離子交換層析獲得較純目的蛋白,復(fù)性后蛋白濃度為1.25mg/ml。PstSl-LEP與結(jié)核病患者血清和抗PstSl單抗呈陽(yáng)性反應(yīng)。肺結(jié)核患者血清中抗PstSl-LEP IgG抗體水平較高,顯著高于肺外結(jié)核病組、肺部疾病組和健康人組(P0.05)。208例肺結(jié)核患者和43例PPD-健康者血清IgG OD492nm.采用ROE分析確定臨界值為0.43,PstSl-LEP用于血清學(xué)診斷的靈敏度和特異性、陽(yáng)性預(yù)示值、陰性預(yù)示值分別為69.5%、68.4%、79.9%和55.3%；PstSl-LEP用于肺結(jié)核患者血清學(xué)診斷敏感度顯著高于肺外結(jié)核(78.8%vs52.2%,χ2=23.60,P=0.000)。208例肺結(jié)核患者和46例肺部疾病患者血清IgG0D492nm采用ROC分析確定臨界值為0.44,PstS1-LEP用于血清學(xué)診斷的靈敏度和特異性、陽(yáng)性預(yù)示值、陰性預(yù)示值分別為67.9%、93.2%、94.8%和61.6%。采用不同對(duì)照進(jìn)行ROC曲線分析獲得不同的cutoff值,以肺部疾病組作對(duì)照,顯著提高了PstSl-LEP血清學(xué)診斷特異度。研究發(fā)現(xiàn)接種BCG影響PstSl-LEP血清學(xué)診斷,因?yàn)榭ê劢M抗PstSl-LEP IgG抗體水平顯著高于無(wú)卡痕組(P=0.008)；健康者皮試反應(yīng)大小也影響PstSl-LEP血清學(xué)診斷,因?yàn)镻PD皮試陽(yáng)性健康組抗PstSl-LEP IgG抗體水平顯著高于PPD皮試陰性健康組(P0.05)。因此,BCG接種和Mtb感染均可能影響PstSl-LEP血清學(xué)用于活動(dòng)性結(jié)核病的診斷；因此,該抗原雖然有一定診斷價(jià)值,但其診斷敏感度和特異度還不能滿足臨床診斷要求。 結(jié)論：PstSl-LEP在大腸桿菌中表達(dá)并具有免疫原性,為進(jìn)一步評(píng)價(jià)PstSl-LEP作為疫苗的候選抗原奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 線性表位 原核表達(dá) 血清學(xué)診斷
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378.911
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 文獻(xiàn)綜述9-25
• 中英文縮略25-27
• 1.引言27-29
• 2.材料29-31
• 2.1 血清樣本29
• 2.2 主要試劑29-30
• 2.3 主要設(shè)備30-31
• 3.實(shí)驗(yàn)所需試劑配制31-35
• 3.1 SDS-PAGE電泳所需試劑31-32
• 3.2 LB培養(yǎng)基32
• 3.3 堿裂解法抽提質(zhì)粒溶液32-33
• 3.4 核酸電泳所需試劑33
• 3.5 蛋白純化、復(fù)性所需試劑33-34
• 3.6 免疫印跡所需試劑34
• 3.7 ELISA所需試劑34-35
• 4.方法35-41
• 4.1 LEP編碼基因人工合成35
• 4.2 原核表達(dá)載體pMD19-T-LEP的構(gòu)建35-36
• 4.3 原核表達(dá)載體pET-28a(+)-PstS1-LEP的構(gòu)建36-37
• 4.4 誘導(dǎo)表達(dá)37-38
• 4.5 免疫印跡鑒定血清免疫原性38-39
• 4.6 Lowry法測(cè)PstS1-LEP蛋白濃度39
• 4.7 ELISA檢測(cè)血清抗體39-40
• 4.8 統(tǒng)計(jì)分析40-41
• 5.結(jié)果41-61
• 5.1 重組質(zhì)粒pMD19-T-LEP表達(dá)載體的構(gòu)建41
• 5.2 pET-28a-PstS1LEP重組表達(dá)載體的構(gòu)建41-42
• 5.3 重組PstS1-LEP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化42-44
• 5.4 PstS1-LEP融合蛋白的免疫印跡44-46
• 5.5 蛋白含量的確定46-47
• 5.6 研究對(duì)象構(gòu)成特征47
• 5.7 ELISA檢測(cè)結(jié)果47-53
• 5.8 不同臨界值下血清學(xué)診斷評(píng)價(jià)53-61
• 6.討論61-65
• 7.結(jié)論65-67
• 8.參考文獻(xiàn)67-75
• 致謝75-77
• 已發(fā)表論文77

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 吳傳勇;婁加陶;蔣廷旺;錢

本文編號(hào)：311589