輪狀病毒（Rotavirus,RV）是一種雙鏈核糖核酸病毒,屬于呼腸孤病毒科,流行病學(xué)調(diào)查顯示,輪狀病毒是秋冬季引起嬰幼兒感染性腹瀉的重要致病因子,全世界每年有大約一億人感染該病毒。目前,研制安全有效的疫苗是控制輪狀病毒感染的重要手段之一。本研究通過(guò)基因克隆和重組技術(shù)檢測(cè)20份患兒的糞便標(biāo)本,提取病毒RNA,再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,根據(jù)GenBank中發(fā)表的VP7全序列設(shè)計(jì)引物,應(yīng)用RT-PCR技術(shù),從分離的輪狀病毒中擴(kuò)增出來(lái)960bp特異性目的片段,并構(gòu)建融合表達(dá)載體pPICZαA-VP7,轉(zhuǎn)入GS115畢赤酵母中。經(jīng)1%甲醇誘導(dǎo),鎳柱親和層析蛋白純化,獲得濃度為0.65mg/mL單一目的蛋白,經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot分析VP7蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示克隆的VP7基因與預(yù)計(jì)的糖蛋白基因大小一致,構(gòu)建的重組表達(dá)載體在GS115畢赤酵母中表達(dá)出分子質(zhì)量約34kD重組糖蛋白,說(shuō)明成功克隆和表達(dá)了輪狀病毒的糖蛋白基因。經(jīng)小鼠免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,VP7蛋白加強(qiáng)免疫2周后,肌注組（IM）和滴鼻組（IN）小鼠IgG抗體幾何平均滴度分別達(dá)到492和676,滴鼻組SIgA平均幾何滴度達(dá)到43... 

【文章來(lái)源】：病毒學(xué)報(bào). 2019,35(05)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：7 頁(yè)

【文章目錄】：
材料與方法
    1菌種與標(biāo)本來(lái)源
    2主要試劑
    3培養(yǎng)基
    4病毒總RNA的提取
    5 RT-PCR擴(kuò)增目的片段
    6重組畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
    7 VP7目的蛋白的表達(dá)
    8重組抗原VP7免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
    9抗體水平檢測(cè)
    10ELISPOT檢測(cè)分泌IFN-γ的小鼠脾淋巴細(xì)胞數(shù)[20]
結(jié)果
    1 VP7基因的克隆
    2陽(yáng)性重組克隆的篩選
    3重組表達(dá)質(zhì)粒PCR與酶切鑒定結(jié)果
    4 VP7蛋白的純化及鑒定
    5 VP7融合蛋白的表達(dá)
    6 VP7免疫小鼠血清IgG抗體水平
    7 VP7免疫小鼠腸勻漿SIgA抗體水平及中和效價(jià)檢測(cè)
    8 ELISPOT計(jì)數(shù)分泌IFN-γ的小鼠脾淋巴細(xì)胞
討論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法與化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)乙型肝炎病毒血清學(xué)標(biāo)志物的準(zhǔn)確率[J]. 張萬(wàn)平.  醫(yī)療裝備. 2019(10)
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博士論文
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碩士論文
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[2]EV71地方株的分離鑒定及其VP1基因真核表達(dá)載體構(gòu)建與免疫活性初步研究[D]. 陳偉.安徽醫(yī)科大學(xué) 2009
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本文編號(hào)：3053695