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輪狀病毒VP7糖蛋白基因的克隆及在畢赤酵母菌中的表達及免疫原性的分析

發(fā)布時間:2021-02-27 04:36
  輪狀病毒(Rotavirus,RV)是一種雙鏈核糖核酸病毒,屬于呼腸孤病毒科,流行病學(xué)調(diào)查顯示,輪狀病毒是秋冬季引起嬰幼兒感染性腹瀉的重要致病因子,全世界每年有大約一億人感染該病毒。目前,研制安全有效的疫苗是控制輪狀病毒感染的重要手段之一。本研究通過基因克隆和重組技術(shù)檢測20份患兒的糞便標(biāo)本,提取病毒RNA,再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,根據(jù)GenBank中發(fā)表的VP7全序列設(shè)計引物,應(yīng)用RT-PCR技術(shù),從分離的輪狀病毒中擴增出來960bp特異性目的片段,并構(gòu)建融合表達載體pPICZαA-VP7,轉(zhuǎn)入GS115畢赤酵母中。經(jīng)1%甲醇誘導(dǎo),鎳柱親和層析蛋白純化,獲得濃度為0.65mg/mL單一目的蛋白,經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot分析VP7蛋白的表達。結(jié)果顯示克隆的VP7基因與預(yù)計的糖蛋白基因大小一致,構(gòu)建的重組表達載體在GS115畢赤酵母中表達出分子質(zhì)量約34kD重組糖蛋白,說明成功克隆和表達了輪狀病毒的糖蛋白基因。經(jīng)小鼠免疫實驗結(jié)果表明,VP7蛋白加強免疫2周后,肌注組(IM)和滴鼻組(IN)小鼠IgG抗體幾何平均滴度分別達到492和676,滴鼻組SIgA平均幾何滴度達到43... 

【文章來源】:病毒學(xué)報. 2019,35(05)北大核心

【文章頁數(shù)】:7 頁

【文章目錄】:
材料與方法
    1菌種與標(biāo)本來源
    2主要試劑
    3培養(yǎng)基
    4病毒總RNA的提取
    5 RT-PCR擴增目的片段
    6重組畢赤酵母表達載體的構(gòu)建
    7 VP7目的蛋白的表達
    8重組抗原VP7免疫動物實驗
    9抗體水平檢測
    10ELISPOT檢測分泌IFN-γ的小鼠脾淋巴細胞數(shù)[20]
結(jié)果
    1 VP7基因的克隆
    2陽性重組克隆的篩選
    3重組表達質(zhì)粒PCR與酶切鑒定結(jié)果
    4 VP7蛋白的純化及鑒定
    5 VP7融合蛋白的表達
    6 VP7免疫小鼠血清IgG抗體水平
    7 VP7免疫小鼠腸勻漿SIgA抗體水平及中和效價檢測
    8 ELISPOT計數(shù)分泌IFN-γ的小鼠脾淋巴細胞
討論


【參考文獻】:
期刊論文
[1]酶聯(lián)免疫吸附試驗法與化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測乙型肝炎病毒血清學(xué)標(biāo)志物的準(zhǔn)確率[J]. 張萬平.  醫(yī)療裝備. 2019(10)
[2]輪狀病毒腸炎患兒糞便IL-6、IL-8的動態(tài)水平變化檢測及意義[J]. 楊輝.  湖北科技學(xué)院學(xué)報(醫(yī)學(xué)版). 2019(01)
[3]復(fù)方甘草酸苷注射液治療輪狀病毒腸炎合并肝功能異常80例分析[J]. 王沁芳,趙青.  中國藥物與臨床. 2019(03)
[4]輪狀病毒檢測及診斷研究進展[J]. 許春,謬如君,賴宇.  醫(yī)學(xué)理論與實踐. 2018(24)
[5]布魯菌L7/L12蛋白的原核表達及多克隆抗體的制備[J]. 成璐,張冬星,吳娟,李影.  動物醫(yī)學(xué)進展. 2018(12)
[6]金雙歧聯(lián)合醒脾養(yǎng)兒顆粒對小兒輪狀病毒腹瀉的療效及對血清IgM、IgG和IgA的影響[J]. 盛瑋,田玉珍.  現(xiàn)代消化及介入診療. 2018(04)
[7]中國輪狀病毒感染性腹瀉免疫預(yù)防進展[J]. 刁連東,湯奮揚,吳疆,孫曉冬.  中國疫苗和免疫. 2018(04)
[8]豬輪狀病毒VP融合蛋白的構(gòu)建及其免疫原性研究[J]. 姚帥,徐進平.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2018(19)
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博士論文
[1]DHV-Ⅰ感染性分子克隆的建立及其衍生病毒的生物學(xué)特性研究[D]. 云濤.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2010

碩士論文
[1]黑曲霉CBS 513.88來源的甘露聚糖酶在畢赤酵母中的表達及酶學(xué)性質(zhì)研究[D]. 李折折.湖北大學(xué) 2015
[2]EV71地方株的分離鑒定及其VP1基因真核表達載體構(gòu)建與免疫活性初步研究[D]. 陳偉.安徽醫(yī)科大學(xué) 2009
[3]豬輪狀病毒JL94株VP4基因克隆及其主要抗原位點的原核表達[D]. 宋巖.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2004



本文編號:3053695

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