目的構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌Rv1787基因的原核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行體外表達(dá),運(yùn)用生物學(xué)信息分析方法分析Rv1787基因編碼蛋白PPE25的生物學(xué)特征。方法以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板,PCR法擴(kuò)增Rv1787基因,并與表達(dá)載體pET-32a構(gòu)建重組質(zhì)粒。原核表達(dá)重組質(zhì)粒,SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物并利用親和層析的方法進(jìn)行純化。利用生物信息學(xué)軟件ProtParam分析PPE25蛋白的理化性質(zhì),TMPRED和SignalP4.1 Service預(yù)測蛋白的跨膜區(qū)和信號(hào)肽,NPS@SOPMA和Swissmodel分別預(yù)測蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu),Bepipred 1.0b server和DNAStar綜合預(yù)測蛋白的B細(xì)胞抗原表位,綜合運(yùn)用SYFPEITHI、BIMAS、NetCTL、RANKPEP、NetMHCⅡPAN 4.0 server預(yù)測蛋白的CTL細(xì)胞表位,綜合運(yùn)用SYFPEITHI、RANKPEP、NetMHCⅡpan 3.2 server預(yù)測蛋白的Th細(xì)胞表位。結(jié)果 pET-32a-Rv1787重組質(zhì)粒測序結(jié)果與目的基因完全一致;SDS-PAGE分析表明,該融合蛋白以包涵體形式... 

【文章來源】：中國病原生物學(xué)雜志. 2019,14(07)北大核心

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

圖１Ｒｖ１７８７基因擴(kuò)增ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ１ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆＲｖ１７８７ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ１Ｒｖ１７８７ＰＣＲ產(chǎn)物

，３７℃４１ｍｍｏｌ／Ｌ，３０℃５２ｍｍｏｌ／Ｌ，３０℃圖３不同誘導(dǎo)條件下ＲＶ１７８７融合蛋白的表達(dá)１ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ２１ｍｍｏｌ／Ｌ，３７℃３２ｍｍｏｌ／Ｌ，３７℃４１ｍｍｏｌ／Ｌ，３０℃５２ｍｍｏｌ／Ｌ，３０℃Ｆｉｇ．３ＴｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｔｏｉｎｄｕｃｅＲＶ１７８７ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ１菌體裂解后上清液２菌體裂解后沉淀３８ｍｍｏｌ／Ｌ尿素裂解的菌體上清液４８ｍｍｏｌ／Ｌ尿素裂解的菌體沉淀圖４Ｒｖ１７８７融合蛋白表達(dá)形式１Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆｃｅｌｌｌｙｓａｔｅ２Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｌｙｓａｔｅ３Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｆｔｅｒｃｅｌｌｌｙｓｅｄｂｙ８ｍｍｏｌ／Ｌｕｒｅａ４Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎａｆｔｅｒｃｅｌｌｌｙｓｅｄｂｙ８ｍｍｏｌ／ＬｕｒｅａＦｉｇ．４ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｆｏｒｍｏｆＲｖ１７８７ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ４重組融合蛋白的純化將裂解后的包涵體離心后收集上清液，采用鎳離子親和層析的方法進(jìn)行純化后獲得一天單一的蛋白條帶，相對(duì)分子質(zhì)量大小約為５６×１０３，與預(yù)期大小一致。從ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結(jié)果表明，５０ｍｍｏ／Ｌ咪唑?yàn)樽罴严疵摑舛龋▓D５）。５蛋白的生物信息學(xué)分析５．１理化性質(zhì)分析采用ＰｒｏｔＰａｒａｍ軟件對(duì)ＲＶ１７８７編碼的ＰＰＥ２５蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示ＰＰＥ２５蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為３７×１０３，理論等電點(diǎn)為９．８０，原子總量為５２０３，消光系數(shù)為６４４００；

氨基酸組成，分子式為Ｃ１６６３Ｈ２５８８Ｎ４６０Ｏ４８０Ｓ１２，主要由Ａｌａ（２１．６％），Ｇｌｙ（９．６％）和Ｓｅｒ（９．０％）構(gòu)成，帶正電荷的氨基酸殘基（Ａｓｐ和Ｇｌｕ）總數(shù)為１３，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Ａｒｇ和Ｌｙｓ）總數(shù)為２０。１包涵體上清液２穿透液３１０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑４２０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑５３０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑６５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑７１００ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑圖５Ｒｖ１７８７融合蛋白純化１Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆｌｙｔｉｃｉｎｃｌｕｓｉｏｎ２ＴｈｅｆｌｕｉｄｆｌｏｗｅｄｔｈｒｏｕｇｈＮｉｃｋｅｌｉｏｎａｆｆｉｎｉｔｙｃｏｌｕｍｎ３Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｆｔｅｒｉｎｃｌｕｓｉｏｎｌｙｓｅｄｗｉｔｈ１０ｍｍｏｌ／Ｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ４Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｆｔｅｒｉｎｃｌｕｓｉｏｎｌｙｓｅｄｗｉｔｈ２０ｍｍｏｌ／Ｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ５Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｆｔｅｒｉｎｃｌｕｓｉｏｎｌｙｓｅｄｗｉｔｈ３０ｍｍｏｌ／Ｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ；Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｆｔｅｒｉｎｃｌｕｓｉｏｎｌｙｓｅｄｗｉｔｈ５０ｍｍｏｌ／Ｌｉｍｉｄａｚ－ｏｌｅ７Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔａｆｔｅｒｉｎｃｌｕｓｉｏｎｌｙｓｅｄｗｉｔｈ１００ｍｍｏｌ／ＬｉｍｉｄａｚｏｌｅＦｉｇ．５ＲｅｓｕｌｔｓｏｆｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲｖ１７８７ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ５．２跨膜區(qū)域和信號(hào)肽分析采用ＴＭＰＲＥＤ工具對(duì)ＰＰＥ２５蛋白跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示得分大于５００的區(qū)域有１１個(gè)，包括

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3047834