本文關(guān)鍵詞：膽固醇代謝相關(guān)酶Srebf2，Hmgcr，CYP51，Clusterin在ALS轉(zhuǎn)基因小鼠模型脊髓中的mRNA水平變化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）是運動神經(jīng)元�。∕ND）最常見的類型。脊髓前角運動神經(jīng)元，腦干后組運動神經(jīng)核及錐體束均有選擇性受累。ALS病理表現(xiàn)為脊髓和延髓上下運動神經(jīng)元損害并存，疾病后期病人呼吸機無力致呼吸衰竭并發(fā)肺部感染而死亡。為了進一步深入探索ALS的發(fā)病機制，我們對經(jīng)典的ALS動物模型（SOD1G93A轉(zhuǎn)基因動物）進行了Microarray全基因表達譜分析，以及散發(fā)ALS病人的血清進行了質(zhì)譜篩查，發(fā)現(xiàn)膽固醇代謝通路多個環(huán)節(jié)的酶存在異常改變。大腦占整個機體體重的2%，但大腦膽固醇占整個機體膽固醇總量的25%。膽固醇是構(gòu)成細胞的重要成份之一，它分布于人體各組織中，其中在腦組織中含量最豐富。膽固醇在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，膜運輸，信號轉(zhuǎn)導，突觸形成以及神經(jīng)元發(fā)揮正常功能都有重要作用。不同與其他系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)膽固醇多來源于自身合成，神經(jīng)系統(tǒng)膽固醇主要由星形膠質(zhì)細胞，少突膠質(zhì)細胞合成，膽固醇在膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元間可以運輸，維持穩(wěn)定狀態(tài)，由于血腦屏障的存在，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周器官的膽固醇代謝相對隔離。一旦神經(jīng)系統(tǒng)膽固醇代謝受到影響，神經(jīng)元功能就會受到影響，最終導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常及顯著的神經(jīng)變性。神經(jīng)系統(tǒng)膽固醇代謝異常見于多種神經(jīng)變性疾病。亨廷頓病病人及動物模型中發(fā)現(xiàn)有血漿膽固醇水平降低，神經(jīng)系統(tǒng)膽固醇合成減少，神經(jīng)元細胞膜膽固醇增多。在阿爾茲海默病細胞及動物模型中，膽固醇水平升高可以增加腦內(nèi)淀粉樣蛋白，而他汀類藥物可以降低淀粉樣蛋白。多項研究表明ALS（肌萎縮側(cè)索硬化）病人存在能量代謝異常，高脂血癥為預后保護因素。SOD1G93A小鼠也有類似報道。本實驗室SOD1G93A小鼠基因表達譜資料顯示，膽固醇代謝通路異常。Srebf2，CYP51，LSS, HMG-Coas，HMG-Coar，DCRH7，lpl，ApoE，Clusterin等膽固醇代謝相關(guān)蛋白在ALS小鼠發(fā)病期較對照小鼠均有較顯著的改變。 本實驗應用國際公認的ALS轉(zhuǎn)基因模型（SOD1G93A小鼠）來研究SOD1-G93A小鼠60天及癥狀早期腰髓srebf2， hmgcr，CYP51以及clusterin的表達差異，進行RT-PCR實驗驗證表達譜結(jié)果，探索ALS疾病中脊髓膽固醇代謝的變化。 方法：（l）轉(zhuǎn)基因鼠的繁殖所有動物均飼養(yǎng)在恒溫、恒濕和無菌條件的(Specificpathogenfree，SPF)環(huán)境中，喂以滅菌的SPF級顆粒型鼠類飼料。為維持B6SJL．TgN(SODlG93A)lGur轉(zhuǎn)基因小鼠突變基因穩(wěn)定下傳，將B6SJLSODlG93A／+半合子雄鼠與B6SJLFl／J半合子雌鼠交配繁殖．子代鼠經(jīng)基因鑒定確定是否帶有人突變SOD1G93A的基因。（2）實驗分組研究對象共分為兩組組：60天，癥狀早期(120天左右)。每個時期組選擇雌性SODlG93A小鼠及同窩野生型小鼠各3只。（3）基因芯片結(jié)果分析和篩選通過分析本實驗室的轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓基因芯片數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)有20個膽固醇代謝相關(guān)酶有變化，其中下調(diào)的包括：Srebf2，Hmgcr，Hmgcs1，mvk，Pmvk，mvd，F(xiàn)DFT1，SQLE，，LSS，DHCR24，CYP51，DHCR7，SC4MOL，NSDH1，SC5D，ldlr；上調(diào)的有：Ch25h, ApoE, Clusterin, Lrp1,選取srebf2， hmgcr，CYP51以及clusterin。進行RT-PCR實驗驗證表達譜結(jié)果。（4）Srebf2, Hmgcr, CYP51, Clusterin基因表達水平的測定用滅活RNase器械取材，取小鼠腰膨大，放入-80℃保存。采用Primer Premier5.0設計上下游引物（跨內(nèi)含子），采用Oligo7.0分析引物，確定最終引物。采用Trizol法提取總RNA，測RNA濃度。Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄后進行上述四個基因的RT-PCR。 結(jié)果：基因表達譜結(jié)果表明在癥狀早期小鼠脊髓中，Srebf2，Hmgcr,CYP51均降低，而Clusterin在發(fā)病小鼠脊髓中水平升高。在隨后的RT-PCR實驗中，與同窩對照相比，SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠在60天，癥狀早期脊髓中Srebf2,Hmgcr, CYP51基因表達均無明顯變化；而在癥狀早期clusterin在轉(zhuǎn)基因小鼠中有明顯升高。和我們的ALS病人血清蛋白組學資料一致的是，ALS病人血清內(nèi)Clusterin水平升高。 結(jié)論：本實驗在肌萎縮側(cè)索硬化SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)疾病癥狀早期脊髓clusterin mRNA水平有基因表達上調(diào)，但其他與膽固醇代謝相關(guān)的酶mRNA水平?jīng)]有明顯變化。提示ALS發(fā)病中Clusterin可能在非膽固醇代謝通路上發(fā)揮作用，但并不能排除膽固醇代謝在ALS中完全沒有變化。同時，Clusterin水平在ALS病人血清中水平升高，提示Clusterin可能成為ALS新型生物學標記物。
【關(guān)鍵詞】：肌萎縮側(cè)索硬化 膽固醇代謝 Clusterin Hmgcr CYP51
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R746.4;R-332
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 前言10
• 材料與方法10-16
• 結(jié)果16-18
• 附圖18-22
• 附表22-24
• 討論24-29
• 結(jié)論29
• 參考文獻29-33
• 綜述 Clusterin 生物學特征及其和相關(guān)疾病的聯(lián)系33-43
• 參考文獻39-43
• 致謝43-44
• 個人簡歷44

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本文編號：300189