本文關(guān)鍵詞：GATA4和HNF4α介導(dǎo)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝細(xì)胞是肝臟生理功能的主要執(zhí)行者，在基礎(chǔ)研究，，藥物研發(fā)及肝病細(xì)胞治療中具有重要的應(yīng)用價值，然而肝細(xì)胞來源短缺的狀況嚴(yán)重地制約著相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，并阻礙了其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的進(jìn)程。因此，探索如何獲取大量、純凈、健康、合格的肝細(xì)胞具有非常重要的意義。由于直接分離的原代肝細(xì)胞培養(yǎng)相對困難且供體來源短缺，因此從易于培養(yǎng)的細(xì)胞誘導(dǎo)獲得功能性肝（樣）細(xì)胞成為國內(nèi)外的研究熱點。目前這方面的研究取得了顯著進(jìn)展，但是由于某些不可避免的局限性，這些誘導(dǎo)起始細(xì)胞或誘導(dǎo)策略各有優(yōu)劣。其中，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)不僅具有干細(xì)胞的特性，而且來源豐富、取材方便、擴(kuò)增迅速，還具有更低的免疫原性及一定的肝源性，成為目前理想的誘導(dǎo)性肝樣細(xì)胞來源。本研究借鑒體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為肝樣細(xì)胞的誘導(dǎo)策略，采用慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將肝富集轉(zhuǎn)錄因子GATA4和HNF4α轉(zhuǎn)入hUC-MSCs中，進(jìn)行肝細(xì)胞方向的定向誘導(dǎo)分化，取得了較好的結(jié)果。 本研究利用組織塊貼壁培養(yǎng)法，從臍帶基質(zhì)分離獲得了生長性狀穩(wěn)定，均質(zhì)性良好的hUC-MSCs。在組織塊貼壁培養(yǎng)3~4d時，觀察到組織塊間隙有小三角形或紡錘形細(xì)胞鋪展開來，培養(yǎng)至第7d時取出組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)一周左右，細(xì)胞匯合至約90%時進(jìn)行傳代。傳代后，細(xì)胞約4h貼壁，2d后迅速生長，呈現(xiàn)典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，具有清晰的輪廓及內(nèi)部應(yīng)力纖維，多為星形或紡錘形的扁平狀結(jié)構(gòu)，其細(xì)胞核呈卵圓形，核仁大而明顯；當(dāng)細(xì)胞基本達(dá)到完全匯合時，呈平行排列或漩渦生長。通過細(xì)胞免疫熒光染色鑒定分離獲得的細(xì)胞幾乎全部為CD44陽性。 本研究以上述分離、鑒定的hUC-MSCs為誘導(dǎo)肝細(xì)胞的起始細(xì)胞。利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將包含GATA4或HNF4α的慢病毒表達(dá)載體和包裝系統(tǒng)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞，制備重組慢病毒。用兩種重組慢病毒侵染P6代的hUC-MSCs，在侵染后約兩周，可觀察到表達(dá)GFP的、具有典型上皮樣細(xì)胞形態(tài)的的肝樣細(xì)胞克隆，其體積較小，細(xì)胞核較大，有1~3個核仁，呈小三角形或不規(guī)則形上皮樣，大多數(shù)細(xì)胞有胞質(zhì)突起。通過RT-PCR檢測到，hUC-MSCs本身表達(dá)部分肝系基因CK19、EpCAM、CK18、ALB、G6P、GLUL和MET；而誘導(dǎo)細(xì)胞除表達(dá)上述基因外，與誘導(dǎo)前的hUC-MSCs相比，開啟了TAT的表達(dá)，抑制了IL6的表達(dá)；功能檢測顯示部分誘導(dǎo)細(xì)胞具有成熟肝細(xì)胞攝取與排泌ICG的功能。 綜上結(jié)果表明，本研究從臍帶基質(zhì)獲得了具有肝源性的hUC-MSCs，并進(jìn)一步利用肝富集轉(zhuǎn)錄因子組合GATA4和HNF4α誘導(dǎo)其定向分化為具有肝細(xì)胞特性的肝樣細(xì)胞。
【關(guān)鍵詞】：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 肝樣細(xì)胞 GATA4 HNF4α 細(xì)胞分化
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 縮略語表11-13
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述13-31
• 1 hUC-MSCs 向肝樣細(xì)胞分化的研究進(jìn)展14-21
• 1.1 hUC-MSCs 的生物學(xué)特性14-16
• 1.2 hUC-MSCs 向肝樣細(xì)胞分化的體外研究16-18
• 1.3 hUC-MSCs 向肝樣細(xì)胞分化的體內(nèi)及臨床研究18-20
• 1.4 hUC-MSCs 的應(yīng)用所面臨的問題與前景20-21
• 2 肝樣細(xì)胞的誘導(dǎo)方法21-26
• 2.1 細(xì)胞因子誘導(dǎo)法21-23
• 2.2 轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)法23-24
• 2.3 miRNA 誘導(dǎo)法24-25
• 2.4 微環(huán)境誘導(dǎo)法25-26
• 3 肝富集轉(zhuǎn)錄因子的功能26-28
• 3.1 GATA4 在肝臟發(fā)育中的功能27
• 3.2 HNF4α在肝臟發(fā)育中的功能27-28
• 4 本研究的目的和意義28-31
• 4.1 研究目的28
• 4.2 研究意義28-31
• 第二部分 材料和方法31-46
• 1 實驗材料31-34
• 1.1 實驗細(xì)胞及質(zhì)粒31
• 1.2 主要試劑與溶液配置31-33
• 1.3 實驗室儀器設(shè)備33
• 1.4 主要耗材33-34
• 2 實驗方法34-46
• 2.1 質(zhì)粒的提取34
• 2.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備34-35
• 2.3 重組慢病毒載體的構(gòu)建35-36
• 2.4 hUC-MSCs 的分離、培養(yǎng)與鑒定36-38
• 2.5 鼠尾膠原蛋白的制備及包被38-39
• 2.6 細(xì)胞的復(fù)蘇及培養(yǎng)39
• 2.7 慢病毒的制備與侵染性能檢測39-40
• 2.8 肝樣細(xì)胞的誘導(dǎo)及誘導(dǎo)細(xì)胞的培養(yǎng)40-41
• 2.9 誘導(dǎo)細(xì)胞的檢測41-46
• 第三部分 結(jié)果和討論46-60
• 1 GATA4 和 HNF4α基因擴(kuò)增及其重組慢病毒載體的構(gòu)建46-47
• 2 hUC-MSCs 的分離、培養(yǎng)與鑒定結(jié)果47-48
• 2.1 hUC-MSCs 的分離、培養(yǎng)結(jié)果47
• 2.2 hUC-MSCs 表面標(biāo)記物 CD44 的免疫熒光鑒定結(jié)果47-48
• 3 重組慢病毒的制備結(jié)果48-49
• 4 重組慢病毒的濃縮及其侵染性能的檢測結(jié)果49-50
• 5 hUC-MSCs 向肝細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo)結(jié)果與分析50-53
• 5.1 GATA4 和 HNF4α重組慢病毒對 hUC-MSCs 的侵染結(jié)果50-51
• 5.2 GATA4 和 HNF4α介導(dǎo)的 hUC-MSCs 向肝細(xì)胞定向分化的結(jié)果51-52
• 5.3 RT-PCR 法分析誘導(dǎo)細(xì)胞的基因表達(dá)情況52
• 5.4 誘導(dǎo)細(xì)胞的功能檢測—ICG 的攝取與排泌52-53
• 6 小結(jié)53
• 7 討論53-60
• 結(jié)論60-62
• 參考文獻(xiàn)62-71
• 致謝71-72
• 攻讀碩士學(xué)位期間參加的科研項目和發(fā)表論文72-73

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本文編號：299767