本文關(guān)鍵詞：遲鈍愛(ài)德華氏菌侵染巨噬細(xì)胞以及擴(kuò)散感染機(jī)制的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：遲鈍愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda)是一種重要的胞內(nèi)寄生革蘭氏陰性病原菌,能夠在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活并復(fù)制是其重要的一個(gè)致病機(jī)理。但是目前對(duì)于遲鈍愛(ài)德華氏菌與巨噬細(xì)胞的相互作用的胞內(nèi)過(guò)程和具體機(jī)制還不是很清楚。本課題中,通過(guò)透射電鏡發(fā)現(xiàn)遲鈍愛(ài)德華氏菌在一個(gè)膜包裹的囊泡結(jié)構(gòu)中存在并復(fù)制,我們稱之為含菌囊泡(Edwardsiella-containing vacuole, ECV)。通過(guò)熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn),內(nèi)化的遲鈍愛(ài)德華氏菌能夠在巨噬細(xì)胞內(nèi)不均一性的復(fù)制,其中有一部分細(xì)胞內(nèi)含有超級(jí)增殖的菌,占總細(xì)胞數(shù)的30%左右。這部分超級(jí)增殖的細(xì)菌能夠在巨噬細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)焦亡導(dǎo)致細(xì)胞膜的破裂,表現(xiàn)為caspase-1的激活以及IL-1β的釋放,細(xì)菌利用這種細(xì)胞死亡途徑從細(xì)胞內(nèi)被釋放到胞外,為進(jìn)一步感染提供了條件。將這部分從巨噬細(xì)胞內(nèi)釋放的遲鈍愛(ài)德華氏菌與同步體外培養(yǎng)的遲鈍愛(ài)德華氏菌相比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們具有更強(qiáng)的二次感染能力,能夠在二次感染中引起一種依賴于caspase-3和組織蛋白酶B/D的快速細(xì)胞死亡,也具有更強(qiáng)的抵抗宿主殺傷能力,包括對(duì)活性氧、酸性環(huán)境、血清和中心粒細(xì)胞的殺傷抵抗。將從巨噬細(xì)胞內(nèi)釋放的遲鈍愛(ài)德華氏菌與同步體外培養(yǎng)的細(xì)菌等量混合后感染小鼠,從巨噬細(xì)胞內(nèi)釋放的遲鈍也表現(xiàn)出壓倒性的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),具有更強(qiáng)的毒力。這些結(jié)果表明,遲鈍愛(ài)德華氏菌通過(guò)在巨噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制與增殖使其本身的毒力得到了增強(qiáng),可能為進(jìn)一步擴(kuò)散感染做好準(zhǔn)備。進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果揭示出,從巨噬細(xì)胞中逃離的遲鈍愛(ài)德華氏菌的大量毒力相關(guān)基因的表達(dá)水平受到明顯的調(diào)控,包括毒力相關(guān)的T3SS、 T6SS和其它壓力應(yīng)激相關(guān)的基因,這些基因變化的綜合結(jié)果可能導(dǎo)致了其毒力水平的增強(qiáng)。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)遲鈍愛(ài)德華氏菌能夠利用巨噬細(xì)胞作為一個(gè)短暫的避難所進(jìn)行胞內(nèi)復(fù)制和侵染馴化,為進(jìn)一步擴(kuò)散感染提供條件。
【關(guān)鍵詞】：遲鈍愛(ài)德華氏菌 巨噬細(xì)胞 侵染馴化
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第1章 文獻(xiàn)綜述11-20
• 1.1 遲鈍愛(ài)德華氏菌及其致病機(jī)制11-13
• 1.1.1 遲鈍愛(ài)德華氏菌的基本介紹11
• 1.1.2 遲鈍愛(ài)德華氏菌的毒力機(jī)制研究進(jìn)展11-13
• 1.2 宿主免疫系統(tǒng)13-16
• 1.2.1 先天性免疫系統(tǒng)13-16
• 1.2.2 適應(yīng)性免疫系統(tǒng)16
• 1.3 病原菌侵染宿主細(xì)胞的機(jī)制研究16-18
• 1.3.1 病原菌入侵機(jī)制17
• 1.3.2 病原菌胞內(nèi)存活機(jī)制17-18
• 1.4 細(xì)胞死亡18-19
• 1.4.1 凋亡18
• 1.4.2 焦亡18-19
• 1.5 本課題的主要內(nèi)容和意義19-20
• 第2章 E.tarda侵染巨噬細(xì)胞的胞內(nèi)過(guò)程及機(jī)制20-35
• 2.1 引言20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料20-22
• 2.2.1 藥品與儀器設(shè)備20
• 2.2.2 菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞株20
• 2.2.3 培養(yǎng)基20-22
• 2.2.4 常用試劑22
• 2.2.5 主要技術(shù)服務(wù)及軟件22
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法22-27
• 2.3.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備22-23
• 2.3.2 大腸桿菌的鈣轉(zhuǎn)化23
• 2.3.3 細(xì)菌質(zhì)粒和基因組提取23
• 2.3.4 遲鈍愛(ài)德華氏菌感受態(tài)細(xì)胞的制備23
• 2.3.5 遲鈍愛(ài)德華氏菌的電轉(zhuǎn)化23-24
• 2.3.6 DNA的瓊脂糖凝膠電泳24
• 2.3.7 DNA產(chǎn)物純化及DNA電泳膠回收24
• 2.3.8 PCR方法24
• 2.3.9 菌落PCR24-26
• 2.3.10 體外條件下熒光強(qiáng)度的檢測(cè)26
• 2.3.11 巨噬細(xì)胞J774A.1的培養(yǎng)26
• 2.2.12 巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌侵染動(dòng)力學(xué)的測(cè)定26-27
• 2.3.13 倒置熒光顯微鏡實(shí)時(shí)觀察胞內(nèi)細(xì)菌復(fù)制27
• 2.3.14 透射電鏡樣品制備27
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-32
• 2.4.1 遲鈍愛(ài)德華氏菌熒光標(biāo)記菌株的構(gòu)建27-28
• 2.4.2 遲鈍愛(ài)德華氏菌熒光標(biāo)記菌株體外表達(dá)熒光強(qiáng)度的測(cè)定28-29
• 2.4.3 遲鈍愛(ài)德華氏菌侵染巨噬細(xì)胞J774A.1的侵染動(dòng)力學(xué)29-30
• 2.4.4 遲鈍愛(ài)德華氏菌野生株利用T3SS在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖30-31
• 2.4.5 遲鈍愛(ài)德華氏菌在巨噬細(xì)胞J774A.1內(nèi)的定位31-32
• 2.5 討論32-33
• 2.6 結(jié)論33-35
• 第3章 E.tarda誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡而逃離巨噬細(xì)胞35-46
• 3.1 引言35
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料35-37
• 3.2.1 藥品與儀器設(shè)備35
• 3.2.2 菌株,質(zhì)粒及引物35
• 3.2.3 常規(guī)培養(yǎng)基以及試劑35-37
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法37-39
• 3.3.1 熒光定量PCR(qRT-PCR)37
• 3.3.2 炎癥小體激活檢測(cè)37-38
• 3.3.3 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)38-39
• 3.3.4 細(xì)胞毒性LDH檢測(cè)39
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-44
• 3.4.1 遲鈍愛(ài)德華氏菌侵染巨噬細(xì)胞后凋亡基因的檢測(cè)39-41
• 3.4.2 遲鈍愛(ài)德華氏菌侵染巨噬細(xì)胞后細(xì)胞死亡的檢測(cè)41
• 3.4.3 遲鈍愛(ài)德華氏菌侵染巨噬細(xì)胞后期引起細(xì)胞死亡類型的檢測(cè)41-43
• 3.4.4 遲鈍愛(ài)德華氏菌逃離到細(xì)胞上清中的活菌數(shù)檢測(cè)43-44
• 3.5 討論44
• 3.6 總結(jié)44-46
• 第4章 逃離巨噬細(xì)胞的E. tarda野生株的毒力增強(qiáng)46-62
• 4.1 引言46
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料46-47
• 4.2.1 藥品與儀器設(shè)備46
• 4.2.2 菌株、細(xì)胞及小鼠46
• 4.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)基46-47
• 4.2.4 化學(xué)試劑47
• 4.2.5 抑制劑47
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法47-52
• 4.3.1 從巨噬細(xì)胞中逃離出來(lái)的EIB202和同步培養(yǎng)的EIB202細(xì)菌的制備47
• 4.3.2 小鼠原代肺和腎細(xì)胞的分離和培養(yǎng)47-48
• 4.3.3 遲鈍野生株EIB202的二次侵染實(shí)驗(yàn)48
• 4.3.4 細(xì)菌侵染細(xì)胞粘附率和內(nèi)化率48-49
• 4.3.5 DAPI和PI染色49
• 4.3.6 抑制劑實(shí)驗(yàn)49
• 4.3.7 細(xì)胞內(nèi)化抑制實(shí)驗(yàn)49
• 4.3.8 壓力應(yīng)激實(shí)驗(yàn)49
• 4.3.9 小鼠血清的分離49-50
• 4.3.10 抗血清殺傷實(shí)驗(yàn)50
• 4.3.11 中心粒細(xì)胞的分離與培養(yǎng)50-51
• 4.3.12 抗中心粒細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)51
• 4.3.13 小鼠競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)51-52
• 4.3.14 小鼠存活率實(shí)驗(yàn)52
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-59
• 4.4.1 從巨噬細(xì)胞中逃離的EIB202在二次感染中引起細(xì)胞死亡的檢測(cè)52-56
• 4.4.2 從巨噬細(xì)胞中逃離的EIB202在二次感染中引起細(xì)胞死亡類型的檢測(cè)56-58
• 4.4.3 從巨噬細(xì)胞中逃離的EIB202抵抗宿主殺傷能力的檢測(cè)58-59
• 4.4.4 從巨噬細(xì)胞中逃離的EIB202的小鼠體內(nèi)存活能力檢測(cè)59
• 4.5 討論59-61
• 4.6 小結(jié)61-62
• 第5章 從轉(zhuǎn)錄組水平考察E.tarda毒力增強(qiáng)的分子機(jī)制62-65
• 5.1 引言62
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料62
• 5.2.1 藥品與儀器設(shè)備62
• 5.2.2 菌株、細(xì)胞62
• 5.2.3 主要技術(shù)服務(wù)及軟件62
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法62-63
• 5.3.1 從巨噬細(xì)胞中逃離出的EIB202和同步培養(yǎng)的EIB202的制備62
• 5.3.2 細(xì)菌RNA的抽提62
• 5.3.3 RNA-seq基因轉(zhuǎn)錄水平分析62-63
• 5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論63-64
• 5.5 小結(jié)64-65
• 第6章 結(jié)論與展望65-67
• 6.1 總結(jié)65-66
• 6.2 展望66-67
• 參考文獻(xiàn)67-73
• 致謝73

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1 張曉君,陳翠珍,房海,戰(zhàn)文斌,葛慕湘,鞏元芳;牙鲆遲鈍愛(ài)德華氏菌吲哚陰性變異株感染癥及其病原特性研究[J];中國(guó)人獸共患病雜志;2004年12期

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3 唐德q

本文編號(hào)：295220